(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.11.20C N 103397106 A (21)申请号 201310302713.9
(22)申请日 2013.07.18
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(71)申请人中国水产科学研究院珠江水产研究
所
地址510380 广东省广州市荔湾区西朗兴渔
路1号
(72)发明人刘春 曾伟伟 李凯彬 王庆
王芳 常藕琴 梁慧丽 梁惜梅
吴淑勤
(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有
限公司 44205
代理人谭英强
(54)发明名称
其检测方法
(57)摘要
本发明公开了杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR
检测试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有特异性
引物HSHRV-2F 、HSHRV-2R 和探针HSHRV-2probe ，
将该试剂盒用于检测杂交鳢弹状病毒，具有灵敏
度高、重复性强、特异性好的特点，能够快速、准确
地对杂交鳢弹状病毒进行定性和定量，对于杂交
鳢病毒病的早期诊断、分子流行病学研究以及防
控技术研究等具有重要意义。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页
序列表2页 附图3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图3页(10)申请公布号CN 103397106 A
*CN103397106A*
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1.杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR 检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR 引物HSHRV-2F 、HSHRV-2R 和探针HSHRV-2 probe ；（2）荧光定量PCR 反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR 引物和探针的核苷酸序列如下：
HSHRV-2F ：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；
HSHRV-2R ：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；
HSHRV-2 probe ：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA ，反转录获得cDNA ，然后以cDNA 为模板，以P1、P2为引物，进行PCR 扩增，将回收
纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCG GATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGC AGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：将扩增产物连接到pMD18-T 载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR 反应液含有Premix Ex Taq TM ，ROX Reference Dye Ⅱ。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为ddH 2O 。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5'端标记荧光染料FAM ，3'端标记淬灭基团BHQ 。
7.杂交鳢弹状病毒的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待检样本的总RNA ，反转录获得cDNA ；
2)以cDNA 为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR 检测试剂盒进行特异性RT-PCR 扩增；
3)反应结束，根据待检样本的Ct 值判断其为杂交鳢弹状病毒阳性或阴性；
其中，杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR 检测试剂盒如权利要求1～6任意一项所述。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应体系为：10μL 的Premix Ex Taq TM ；0.4μL 的50×ROX Reference Dye Ⅱ；0.3μmol/L 的引物HSHRV-2F ；0.3μmol/L 的引物HSHRV-2R ；0.24μmol/L 的探针HSHRV-2 probe ；2μL 的cDNA 模板；加ddH 2O 补足体积至20μL 。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的扩增反应程序为：94℃ 2min ； 94℃ 15s ，55℃15 s ，72℃ 20s ，5个循环；94℃ 5s ，55℃ 35s ，40个循环。权 利 要 求 书CN 103397106 A
杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于病原微生物的检测领域，特别涉及杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
[0002] 杂交鳢（Channa maculata♀×C. argus♂）是以斑鳢为母本，乌鳢为父本，通过杂交获得的子一代，杂交鳢综合了亲本的优点，在实际生产过程中具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、耐运输、易驯食人工配合饲料等优点。由于杂交鱧的养殖经济效益明显，近年在全国范围内养殖规模不断扩大，已逐步替代乌鳢、斑鳢等鱧科鱼类成为主要的养殖品种。然而，2012年的7月以来，广东省的广州、佛山、中山、清远等多个地方养殖场暴发杂交鳢大规模死亡的流行性疾病，造成巨大的经济损失。杂交鳢弹状病毒病是近年新发的流行性疾病，该病发病迅速、死亡率高，给鳢科鱼类养殖业造成了重大的经济损失，目前还没有该病的致病机理和流行病学研究相关的报道。由于发病初期鱼体没有明显的表观症状，快速准确地诊断以及病毒病原的定量检测对于该病的预警与防控技术研究十分重要。
[0003] 本实验室从细菌学和病毒学两方面对患病鱼进行分析，确认引起养殖鱼暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为杂交鳢弹状病毒(Hybrid Snakehead rhabdovirus，HSHRV)。
[0004] 弹状病毒为线性负义单链RNA病毒，病毒粒子长100～430nm，直径45～100nm，形态似棒状或子弹状，通常具有5种主要结构蛋白（L，G，N，P，M）。弹状病毒科包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物及植物。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有二十多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒（SVCV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、牙鲆弹状病毒（HRV）和鳜鱼弹状病毒（SCRV）等。弹状病毒科分为6个属，即水泡性病毒属（Vesiculovirus）、狂
犬病毒属（Lyssavirus）、短暂热病毒属（Ephemerovirus）、诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus）、质型弹状病毒属（Cytorhabdovirus）和细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus）。HSHRV是弹状病毒科水泡性病毒属成员，与20世纪八十年代国外报道的诺拉弹状病毒属的乌鳢弹状病毒（SHRV）亲缘关系较远，二者全基因核苷酸序列同源性仅为45.3%；与SCRV亲缘关系较近，全基因核苷酸序列同源性高达94.9%。本实验室研究发现引起广东省杂交鳢死亡的HSHRV主要流行株为C1207株，该毒株能在多种鱼类细胞中复制，人工感染杂交鱧死亡率高达90%。为了及早发现养殖鱼类是否被HSHRV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
[0005] 目前，传统病毒病诊断需进行病毒分离，细胞转染、电镜观察以及普通PCR检测等方法，缺乏可对病毒进行快速、准确、定量分析的检测预警方法。荧光定量PCR方法具有操作简单、快速，不易出现假阳性，随时对扩增产物进行精确定量分析等优点，正逐渐应用于病原微生物的检测与研究中。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
（1）荧光定量PCR引物杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：
（4）
（3）阳性对照；
（2）荧光定量PCR反应液；
HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe；
阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：
HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；
HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；
HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）。
[0008] 优选的，所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCA CT-3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3'（SEQ ID NO.2）。
[0009] 优选的，将扩增产物连接到pMD18-T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照。[0010] 优选的，所述荧光定量PCR反应液含有Premix Ex Taq TM，ROX Reference Dye Ⅱ。[0011] 优选的，所述阴性对照为ddH2O。
[0012] 优选的，所述探针的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。
[0013] 杂交鳢弹状病毒的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待检样本的总RNA，反转录获得cDNA；
2)以cDNA为模板，用杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行特异性RT-PCR扩增；
3)反应结束，根据待检样本的Ct值判断其为杂交鳢弹状病毒阳性或阴性；
其中，杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒如上所述。
[0014] 优选的，所述步骤2）的扩增反应体系为：10μL的Premix Ex Taq TM；0.4μL的50×ROX Reference Dye Ⅱ；0.3μmol/L的引物HSHRV-2F；0.3μmol/L的引物HSHRV-2R；
O补足体积至20μL。
0.24μmol/L的探针HSHRV-2 probe；2μL的cDNA模板；加ddH
2
[0015] 优选的，所述步骤2）的扩增反应程序为：94℃ 2min； 94℃ 15s，55℃15 s，72℃20s，5个循环；94℃ 5s，55℃ 35s ，40个循环。
[0016] 本发明的有益效果是：
本发明提供了杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒含有特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe，将该试剂盒用于检测杂交鳢弹状病毒，具有灵敏度高、重复性强、特异性好的特点，能够快速、准确地对杂交鳢弹状病毒进行定性和定量，对于杂交鳢病毒病的早期诊断、分子流行病学研究以及防控技术研究等具有重要意义。
附图说明
[0017] 图1为阳性对照标准曲线；
图2为特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R传统PCR扩增结果；
图3为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度试验结果；
图4为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的重复性试验结果；
图5为HSHRV荧光定量PCR检测试剂盒的特异性试验结果。
具体实施方式
[0018] 下面结合实施例进一步阐述本发明内容。
[0019] 实施例中所用细胞与病毒：鲤鱼上皮细胞系（EPC）购自武汉大学细胞典藏中心；HSHRV-C1207、草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)、大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)、锦鲤疱疹病毒（KHV）、尖塘鳢虹彩病毒（MSGIV）、IHNV均由发明人所在实验室分离保存。
[0020] 实施例中所用主要试剂：大肠杆菌DH5α由发明人所在实验室保存；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、PrimeScript TM RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒、DNA Taq酶、dNTP、限制性内切酶、pMD18-T载体、T4连接酶、DNA分子Marker、Premix Ex Taq TM （Probe qPCR）购自宝生物工程（大连）有限公司；Plasmid Mini Kit I 购自Omega公司；M199培养基、犊牛血清、胰酶为Gibco公司产品；Trizol Reagent购于Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。
[0021] 实施例1
引物和探针的制备：
第一对引物( P1、P2)扩增产物长度为1560bp，用于构建重组质粒，为制作阳性对照标准曲线提供模板；第二对引物（HSHRV-2F、HSHRV-2R）和探针（HSHRV-2probe）用于荧光定量PCR扩增，扩增产物长度为143bp。引物和探针由广州吉格生物科技有限公司合成。引物和探针序列如下：
P1：5'-CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT-3' （SEQ ID NO.1）；
P2：5'-CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG-3' （SEQ ID NO.2）；
HSHRV-2F：5'-CACCAGTCATATCAATCC-3' （SEQ ID NO.3）；
HSHRV-2R：5'-CGGACTTAAACCTCATTC-3' （SEQ ID NO.4）；
HSHRV-2 probe：5'-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-3' （SEQ ID NO.5）；
HSHRV-2 probe的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。
[0022] 实施例2
杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒的建立和检测方法的优化：
1、标准品模板制备
1)用HSHRV感染EPC，待细胞出现病变后收集细胞毒材料，按Trizol Reagent说明书提取病毒总RNA，经DNase I RNase-free（Fermentas）处理后，分别测量RNA 样品在260nm 和280nm波长下的吸光度值，计算RNA样品的浓度和纯度。
[0023] 2)利用PrimeScript TM RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒进行反转录得到cDNA。以获得的cDNA为模板，P1、P2为引物进行PCR 扩增。反应参数为94℃预变性3min，94℃30s， 55℃ 30s，72℃ 90s，共30个循环，最后72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。
[0024] 3)PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得1500 bp左右的目的片段。扩增
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