(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201910025787.X
(22)申请日 2019.01.11
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 109536423 A
(43)申请公布日 2019.03.29
(83)生物保藏信息
CGMCC No.16671 2018.10.31
(73)专利权人 宁夏医科大学
地址 750004 宁夏回族自治区银川市兴庆
区胜利街1160号
(72)发明人 张新慧 张晓佳 张文晋 郎多勇
张瑜 周丽 高晓娟 余建强
付雪艳
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
专利代理师 关畅
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/085(2006.01)
(56)对比文件
CN 101497868 A ,2009.08.05
WO 2009059253 A2,2009.05.07
CN 103421717 A ,2013.12.04
US 2014322774 A1,2014.10.30
US 2020095558 A1,2020.03.26CN 103070209 A ,2013.05.01CN 103070209 A ,2013.05.01CN 1028
07961 A ,2012.12.05CN 102604872 A ,2012.07.25CN 104560745 A ,2015.04.29CN 106190932 A ,2016.12.07CN 108977400 A ,2018.12.11黄秀敏等.1株益生蜡样芽孢杆菌发酵培养基优化研究.《安徽农业科学》.2016，第4卷(第30期)，管珺.蜡样芽孢杆菌的培养及其在农业领域中的应用研究.《万方数据》.2012，王劲松.益生菌液体发酵条件的优化及单一与复合菌制剂在仔鹅中的应用研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》.2010,(第3期),Aboozar Kazemi等.Isolation , identification , and media optimization of high-level cellulase production by Bacillus sp. BCCS A3, in a fermentation system using response surface methodology.《Preparative biochemistry & biotechnology》.2014，第44卷(第2期)，审查员 李非儿 (54)发明名称 一种蜡样芽孢杆菌的培养方法及其专用培
养基
(57)摘要
本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌的培养方
法及其专用培养基。培养基由葡萄糖、胰蛋白胨、
KH 2PO 4和水组成。培养基中，葡萄糖、胰蛋白胨、
KH 2PO 4和水的比例为1.0重量份：(4.5‑6.5)重量
份：(0.03‑0.07)重量份：(92‑95)重量份。采用本
发明提供的培养基和优化前的培养基分别发酵
培养蜡样芽孢杆菌；结果表明，与优化前的培养基相比，在相同的发酵时间下本发明提供的培养基可使蜡样芽孢杆菌生物量显著增加。由此可见，本发明提供的培养基更加适合蜡样芽孢杆菌的生长，可明显缩短发酵时间，大大降低了生产成本。
本发明具有重要的应用价值。权利要求书1页 说明书8页CN 109536423 B 2022.06.07
C N 109536423
B
1.用于培养蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）的培养基，由葡萄糖、胰蛋白胨、KH 2PO 4和水组成；
所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH 2PO 4和所述水的比例为1.0重量份：4.5‑6.5重量份：0.03‑0.07重量份：92.23‑94.67重量份；
所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）G2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16671。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：
所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为8.0‑12.0g/L；
所述胰蛋白胨在所述培养基中的浓度为45.0‑65.0g/L；
所述KH 2PO 4在所述培养基中的浓度为0.3‑0.7g/L。
3.如权利要求2所述的培养基，
其特征在于：所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/L；
所述胰蛋白胨在所述培养基中的浓度为55g/L；
所述KH 2PO 4在所述培养基中的浓度为0.5g/L。
4.权利要求1至3任一所述的培养基在培养蜡样芽孢杆菌中的应用；
所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）G2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16671。
5.权利要求1至3任一所述的培养基在提高蜡样芽孢杆菌生物量中的应用；
所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）G2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16671。
6.一种蜡样芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：采用权利要求1至3任一所述的培养基培养蜡样芽孢杆菌；
所述培养的条件为：28‑32℃、170‑230rpm振荡培养；
所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）G2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16671。
权 利 要 求 书1/1页CN 109536423 B
一种蜡样芽孢杆菌的培养方法及其专用培养基
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌的培养方法及其专用培养基。
背景技术
[0002]蜡样芽孢杆菌为芽孢杆菌属(Bacillus)中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0‑1.2×3.0‑5.0μm。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～ 1.5μm，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性菌，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。蜡样芽孢杆菌可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境；可产生细菌蛋白酶；可用于麻脱胶，是各种抗生素抗菌活性的测定菌；可用于明胶液化、牛奶胨化、还原硝酸盐、水解淀粉等等；还可制药，主要用于肠炎、腹泻、肠功能紊乱。
[0003]目前，蜡样芽孢杆菌的工业化液体深层发酵工艺普遍存在着发酵水平偏低，芽孢形成不一致，产品质量不稳定等缺陷。一般通过调整发酵过程中的温度、压力、通气搅拌等工艺条件来提高有效活菌数量，对菌种的芽胞采用高温处理，使之在工业发酵过程中能同步形成芽孢，从而提高芽孢形成的数量和比例，缩短发酵时间。然而这些方法实际操作起来甚为麻烦，而且还增加了生产成本。
发明内容
[0004]本发明的目的为提供适宜蜡样芽孢杆菌生长的培养基。
[0005]本发明首先保护一种用于培养蜡样芽孢杆菌的培养基，可包括葡萄糖、胰蛋白胨
和KH
2PO
4
。
[0006]上述培养基还可包括水。
[0007]上述任一所述培养基中，所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH
2PO
4
和所述水的比例
可为1.0重量份：(4.5‑6.5)重量份：(0.03‑0.07)重量份：(92‑95)重量份。
[0008]上述任一所述培养基中，所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH
2PO
4
和所述水的比例
具体可为1.0重量份：5.5重量份：0.05重量份：93重量份。
[0009]上述培养基中，所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH
2PO
4
和所述水的比例具体可为
1.0重量份：4.5重量份：0.03重量份：95重量份。
[0010]上述培养基中，所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH
2PO
4
和所述水的比例具体可为
1.0重量份：6.5重量份：0.07重量份：92重量份。
[0011]上述任一所述培养基具体可由所述葡萄糖、所述胰蛋白胨、所述KH
2PO
4
和所述水组
成。
[0012]上述任一所述培养基中，所述葡萄糖在培养基中的浓度可为(8.0‑12.0)g/L(如 (8.0‑10.0)g/L、(10.0‑12.0)g/L、8.0g/L、10.0g/L或12.0g/L)。所述胰蛋白胨在培养基中的浓度可为(45.0‑65.0)g/L(如(45.0‑55.0)g/L、(55.0‑65.0) g/L、45.0g/L、55.0g/L或
65.0g/L)。所述KH
2PO
4
在培养基中的浓度为(0.3‑0.7) g/L(如(0.3‑0.5)g/L、(0.5‑0.7)g/
L、0.3g/L、0.5g/L或0.7g/L)。
[0013]本发明还保护上述任一所述培养基在培养蜡样芽孢杆菌中的应用。
[0014]本发明还保护上述任一所述培养基在提高蜡样芽孢杆菌生物量中的应用。[0015]上述应用中，所述“提高蜡样芽孢杆菌生物量”主要是蜡样芽孢杆菌适宜于在上述任一所述培养基中生长造成的。
[0016]本发明还保护一种蜡样芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：采用上述任一所述的培养基培养蜡样芽孢杆菌。
[0017]上述方法中，所述培养的条件可为：28‑32℃(如28‑30℃、30‑32℃、28℃、30℃或32℃)、170‑230rpm(如170‑200rpm、200‑230rpm、170rpm、200rpm或230rpm) 振荡培养。[0018]上述任一所
述蜡样芽孢杆菌具体可为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2已于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号)，保藏编号为CGMCC No.16671。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2的全称为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2 CGMCC No.16671。
[0019]将蜡样芽孢杆菌接种至装有150mL优化前的培养基(由1.5重量份葡萄糖、1.5 重量份胰蛋白胨、0.5重量份牛肉膏、0.5重量份NaCl和96重量份水组成)或本发明提供的培养
基(由1.0重量份葡萄糖、5.5重量份胰蛋白胨、0.05重量份KH
2PO
4
和 93重量份水组成)的三
角瓶中，然后置于恒温摇床，30℃、170rpm振荡培养24h，得到发酵液；将发酵液用无菌水稀
释100倍，然后采用紫外分光光度法测定OD
275nm
值。结果表明，与优化前的培养基相比，在相
同的发酵时间采用本发明提供的培养基培养获得的发酵液的稀释液的OD
275nm
值增加185.2％，即本发明提供的培养基可使蜡样芽孢杆菌生物量显著增加。由此可见，本发明提供的培养基更加适合蜡样芽孢杆菌的生长，可明显缩短发酵时间，大大降低了生产成本。本发明具有重要的应用价值。
具体实施方式
[0020]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0021]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0023]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0024]下述实施例中，三角瓶的规格均为250mL。
[0025]蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2已于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16671。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2的全称为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)G2 CGMCC No.16671。在下文中，蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)G2 CGMCC No.16671简称为蜡样芽孢杆菌。
[0026]下述实施例中的种子液为将蜡样芽孢杆菌接种于250mL牛肉膏蛋白胨培养基 (pH7.0)，30℃、170rpm振荡培养24h，得到的培养菌液。
[0027]实施例1、用于培养蜡样芽孢杆菌的培养基的制备
[0028]现有的用于培养蜡样芽孢杆菌的培养基(即优化前的培养基)由1.5重量份葡萄糖、1.5重量份胰蛋白胨、0.5重量份牛肉膏、0.5重量份NaCl和96重量份水组成。本发明的发明人为了制备发酵效果更好的培养基，进行了如下实验。
[0029]一、碳源的优化
[0030]待测培养基由1.5重量份碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D‑聚糖、 D‑木糖或可溶性淀粉)、1.5重量份胰蛋白胨、0.5重量份牛肉膏、0.5重量份NaCl和 96重量份水组成。
[0031]1、将3.061mL种子液接种至装有150mL待测培养基的三角瓶中(接种量为2％(v/ v))，然后置于恒
温摇床，30℃、170rpm振荡培养24h，得到发酵液。
[0032]2、完成步骤1后，用无菌水稀释发酵液100倍，得到发酵液稀释液。
[0033]3、完成步骤2后，采用紫外分光光度法对发酵液稀释液进行全波长扫描。[0034]结果表明，发酵液稀释液在OD
处有最大吸收峰。因此，后续均测定发酵液稀释
275nm
值。
液的OD
275nm
[0035]4、完成步骤3后，采用紫外分光光度法测定发酵液稀释液的OD
值。
275nm
[0036]检测结果见表1。结果表明，当待测培养基中的碳源为葡萄糖时，发酵液稀释液的OD
值最高。由此可见，与其它碳源(如麦芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、D‑聚糖、 D‑木糖、可溶275nm
性淀粉)相比，蜡样芽孢杆菌对葡萄糖的利用率更高。
[0037]表1
[0038]碳源发酵液稀释液的OD
值
275nm
葡萄糖0.144
麦芽糖0.084
乳糖0.101
蔗糖0.100
山梨醇0.117
D‑聚糖0.141
D‑木糖0.100
可溶性淀粉0.063
[0039]二、氮源的优化
[0040]待测培养基由1.5重量份氮源(酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨、花生饼粉、玉米浆干粉或棉籽粉)、1.5重量份葡萄糖、0.5重量份NaCl和96.5重量份水组成。[0041]1、将3.061mL种子液接种至装有150mL待测培养基的三角瓶中(接种量为2％(v/ v))，然后置于恒温摇床，30℃、170rpm振荡培养24h，得到发酵液。
[0042]2、完成步骤1后，用无菌水稀释发酵液100倍，得到发酵液稀释液。
[0043]3、完成步骤2后，采用紫外分光光度法测定发酵液稀释液的OD
值。
275nm
[0044]检测结果见表2。结果表明，当待测培养基中的氮源为胰蛋白胨时，发酵液稀释液值最高。由此可见，与其它氮源(如酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、玉米的OD
275nm
浆干粉、棉籽粉)相比，蜡样芽孢杆菌对胰蛋白胨的利用率更高。
[0045]表2
[0046]氮源发酵液稀释液的OD
值
275nm
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