(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910315358.6
(22)申请日 2019.04.19
(71)申请人 黑龙江八一农垦大学
地址 163000 黑龙江省大庆市高新技术开
发区新风路5号
(72)发明人 朱战波 赫鸣睿 刘宇 周金玲
何泊宁 范春玲 杨玉英 周玉龙
闻晓波 陈楠楠 吴陈华 黄雯静
岳山 贾斌
(74)专利代理机构 大庆禹奥专利事务所 23208
代理人 朱士文 杨晓梅
(51)Int.Cl.
A61K 39/116(2006.01)
A61K 39/102(2006.01)
A61P 31/04(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)C12N 1/36(2006.01)
(54)发明名称牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，该疫苗的有效成分含有抗原和佐剂，其中，抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。本发明还涉及上述疫苗的制备方法和注射剂量。1、本发明的灭活疫苗对目前流行的牛纤维素性化脓性肺炎和肉牛地方流行肺炎提供良好的免疫保护效力，疫苗安全性好，免疫效果稳定，免疫持续期长；2、本发明灭活疫苗的注射剂量为2ml，提高了临床注射操作便利性和疫苗包装利用率；3、疫苗种子液培养过程中不需通气搅拌发酵培养等传统方法，简便了抗原制备生产工艺，既能提高疫 苗抗原纯度又能增强抗原的免疫原性。权利要求书2页 说明书11页 附图15页CN 109847060 A 2019.06.07
C N 109847060
A
1.一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：有效成分包括抗原和佐剂，所述的抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。
2.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×1010CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株包含omp87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、pm HAS、Tbp A、hsf-2、hsf-1、pfh A、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB、tadD共19种毒力基因。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗被免疫动物所产生抗体的ELISA检测方法，其特征在于：
(1)抗原包被多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白4μg/mL、多杀性巴氏杆菌LY01全菌体蛋白160μg/mL；
(2)抗原包被溶血性曼氏杆菌LktA蛋白5μg/mL、溶血性曼氏杆菌LY02全菌体蛋白100μg/mL。
6.一种根据权利要求5所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征
在于：具体步骤如下：
步骤一、通过PCR技术对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株进行鉴定。
步骤二、将步骤一鉴定合格的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株用不通气发酵的方式分别在气浴恒温振荡器中进行液体悬浮增殖培养；
步骤三、步骤二得到的两个菌液离心浓缩、灭活；
步骤四、步骤三得到的灭活后的两个菌液混合制成抗原液，再加入佐剂，充分混合均匀，得牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗。
步骤五、步骤四得到二联灭活疫苗分装，加塞密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
7.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤四中灭活后的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01抗原菌液和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02抗原菌液按照体积比1：1混合制成混合抗原菌液，再按佐剂与混合抗原菌液体积比为4：1加入佐剂，所述的佐剂为氢氧化铝胶。
8.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤二中牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02以1％接种量接种于培养基中，37℃采用振荡
方法培养18-24h。
9.根据权利要求6所述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤三中离心的参数为8000r/min，离心时间30min，保留部分菌液上清液重悬菌体，制成10～100倍浓缩菌液，灭活采用终浓度为0.3％的甲醛溶液灭活，灭活温度37℃，灭活时间24h。
10.权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2mL/头。
牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其
制备方法
技术领域
[0001]本发明属于兽用生物制品领域，特别涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
[0002]在养牛业发达地区，牛呼吸道疾病综合症(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是最普遍的疾病。常见可引起牛呼吸道疾病的病原有：牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性支气管炎病毒、牛副流感3型病毒等，细菌繁殖迅速传播性强，一旦引起动物发病就会造成广泛的流行趋势。
[0003]多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可分为A、B、C、D、E、F六个型，感染牛引起发病的多杀性巴氏杆菌主要是牛B型多杀性巴氏杆菌和牛A型多杀性巴氏杆菌，由牛B型多杀性巴氏杆菌造成的牛出血性败血症(牛出败)在我国已经流行几十年，我国兽医研究人员对牛出败的预防与也取得了显著成效，国内青海生物药品厂、齐鲁动物保健品有限公司和四川伊禾动物药品有限公司都生产预防牛出败的商品化疫苗，由牛A型多杀性巴氏杆菌引起的牛纤维素性肺炎在我国一直未受到重视，21世纪初我国牛A型多杀性巴氏杆菌的流行趋势逐年上升，由牛A型多杀性巴氏杆菌感染引起的犊牛肺炎在中国多个地区规模化牛场中频繁发生，造成犊牛大批死亡，降低了牛场的经济效益并严重影响养牛业的发展。
[0004]溶血性曼氏杆菌是引起反刍动物肺炎和败血症的病原菌，根据菌体表面的蛋白抗原差异和血凝试验分为17个血清型，该菌可在健康反刍动物的上呼吸道内寄生，其中A6型溶血性曼氏杆菌在犊牛肺炎中占主导地位，能够引起肉牛的地方流行性肺炎，还会导致绵羊肺炎和新生羔羊急性败血症，溶血性曼氏
杆菌发现于20世纪末，近几年溶血性曼氏杆菌在我国黑龙江地区流行率较高，在我国其他省份呈地方性流行，给我国的养牛业和养羊业带来巨大的经济损失。
[0005]现在饲料中由于化学添加剂、糖皮质激素及其他免疫抑制剂的大量使用导致动物体免疫功能降低，使家畜患细菌性传染病的几率大大增高。致病菌株抗生素耐药谱的不断扩大，导致供选择药物的种类越来越少，家畜传染病进行抗生素已不再是最佳方案，依靠疫苗免疫来预防细菌性传染病尤为重要。国外已有商品化同时预防牛源溶血性曼氏杆菌病和牛A型多杀性巴氏杆菌病等多种疾病的联合疫苗，但由于不同地区的菌株差异性，这种商品化疫苗不适用于中国的牛病预防，国内兽药市场虽然有预防牛出败的商品化疫苗，研究发现A型和B型多杀性巴氏杆菌之间不能产生完全的交叉保护，免疫牛出败疫苗无法对牛A型多杀性巴氏杆菌产生预防效果，而国内兽药市场尚无同时预防血清A6型牛溶血性曼氏杆菌病和荚膜A型牛多杀性巴氏杆菌病的有效疫苗。本发明所使用的抗原为地方流行菌株，具有地域代表性，对于该地区牛溶血性曼氏杆菌病和牛多杀性巴氏杆菌病的预防更具有现实意义，为了防控牛血清A6型溶血性曼氏杆菌和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌引发的疾病，研
制有效疫苗迫在眉睫。
发明内容
[0006]本发明的目的是为了解决现有技术的问题，提供一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二
联灭活疫苗，可以同时防控牛血清A6型溶血性曼氏杆菌和牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌引发的疾病。
[0007]本发明通过以下技术方案来实现：
[0008]一、一种牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，有效成分包括抗原和佐剂，所述的抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02。
[0009]具体的，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×108-1.0×1010CFU/mL。
[0010]具体的，牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型肺炎病死牛分离株LY01有效抗原量为1.0×1010CFU/mL，牛溶血性曼氏杆菌血清A6型肺炎病死牛分离株LY02有效抗原量为1.0×1010CFU/mL。
[0011]具体的，牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株包含omp87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、pm HAS、Tbp A、hsf-2、hsf-1、pfh A、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB、tadD共19种毒力基因。[0012]具体的，牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗被免疫动物所产生抗体的ELISA检测方法，
[0013](1)抗原包被多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白(4μg/mL)、多杀性巴氏杆菌LY01全菌体蛋白(160μg/mL)；
[0014](2)抗原包被溶血性曼氏杆菌LktA蛋白(5μg/mL)、溶血性曼氏杆菌LY02全菌体蛋白(100μg/mL)。
[0015]二、上述的牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
[0016]步骤一、通过PCR技术对牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株进行鉴定。
[0017]步骤二、将步骤一鉴定合格的牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型LY01株和牛溶血性曼氏杆菌血清A6型LY02株用不通气发酵的方式分别在气浴恒温振荡器中进行液体悬浮增殖培养；
[0018]步骤三、步骤二得到的两个菌液离心浓缩、灭活；
[0019]步骤四、步骤三得到的灭活后的两个菌液混合制成抗原液，再加入佐剂，充分混合均匀，得牛多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病二联灭活疫苗。
[0020]步骤五、步骤四得到二联灭活疫苗分装，加塞密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。[0021]具体的，以牛多杀性巴氏杆菌LY01株提取DNA，根据荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性基因hyaD设计引物进行基因扩增，以牛溶血性曼氏杆菌LY02株提取DNA为模板根据溶血性曼氏杆菌A6血清型特异性基因TupA设计引物进行基因扩增，以牛多杀性巴氏杆菌LY01株
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议