(10)申请公布号 CN 101991566 A
(43)申请公布日 2011.03.30C N 101991566 A
*CN101991566A*
(21)申请号 201010562271.8
(22)申请日 2010.11.26
A61K 31/341(2006.01)
A61P 37/00(2006.01)
A61P 37/06(2006.01)
A61P 5/16(2006.01)
A61P 3/10(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)
A61P 1/04(2006.01)A61P 11/00(2006.01)A61P 13/12(2006.01)A61P 25/00(2006.01)A61P 27/02(2006.01)A61P 9/00(2006.01)A61P 21/04(2006.01)A61P 19/02(2006.01)A61P 29/00(2006.01)A61P 17/00(2006.01)A61P 37/08(2006.01)A61P 11/06(2006.01)(71)申请人中国人民解放军第二军医大学
地址200433 上海市翔殷路800号
(72)发明人于益芝 张卫东 苏娟 曹雪涛
单磊 戴先坤 李江燕 张寿德
(74)专利代理机构上海新天专利代理有限公司
31213
代理人王巍
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了落叶松脂醇在制备抗自身免疫
病和抗移植排斥疾病药物中的应用。本发明通过
增殖、抑制人树突状细胞促进同种异体T 细胞增
殖反应、增强人树突状细胞分泌白细胞介素10
的能力。同时，实验性自身免疫病脑脊髓膜炎
模型中，落叶松脂醇体内应用，能够降低小鼠的
平均临床得分，并能抑制单核细胞的脊髓浸润程
度。心脏移植实验中，落叶松脂醇体内应用，能
够延长移植心脏的存活时间。迟发型超敏反应模
型中，落叶松脂醇体内应用，能够降低小鼠的耳
片肿胀程度。体内和体外的结果，均显示了落叶
松脂醇具有一定的抗自身免疫病和抗移植排斥疾
病作用。本发明药物是由落叶松脂醇作为活性成
分与药用载体组成的制剂。包括口服剂型、注射
剂、栓剂或外用剂型等。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页
1.落叶松脂醇在制备抗自身免疫病和抗移植排斥疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由落叶松脂醇作为活性成分与药用载体组成的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为口服剂型、注射剂、栓剂或外用剂型。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药用载体为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤癣醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖性糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合症、天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合症、硬皮病、结节性多动脉炎、Weganer肉芽肿病、重症肌无力、类风湿性关节炎、肾炎、肾病综合症、药物性皮炎、荨麻疹、日光性皮炎、过敏性休克或哮喘疾病的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为心脏、肝脏、肾脏、肺、皮肤或骨髓移植时
发生的急性、亚急性或慢性移植排斥反应性疾病的药物。
落叶松脂醇在制备抗自身免疫病和抗移植排斥疾病药物中
的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物。具体涉及制备新适应证的药物，尤其涉及落叶松脂醇在制备抗自身免疫病和抗移植排斥疾病药物中的应用。
背景技术
[0002] 现有的免疫抑制剂主要有环孢素A(CsA)、肾上腺皮质激素、雷帕霉素等，它们大多具有明显的不良反应，如肾毒性以及对细胞的非特异性等，而且价格高，增加患者经济负担。如何利用中药及其有效成分预防和自身免疫病和移植排斥是中药现代化研究的重要方向之一。
[0003] 树突状细胞(Dendritic cells，DC)是目前已知的机体中功能最强的抗原提呈细胞，能有效激活初始T细胞增殖分化，调节固有免疫应答细胞和适应性免疫应答细胞的功能，在免疫应答中起主要的作用。而实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)、迟发型超敏反应和心脏移植排斥等都是典型的自身免疫病和移植排斥模型。
[0004] 落叶松脂醇是一种木质素类物质，来源于丝毛瑞香或落叶松。
[0005] 结构式如式(I)所示：
[0006]
[0007] 式(I )
[0008] 目前已发现丝毛瑞香具有抑制风湿性关节炎，坐骨神经痛，咽炎，牙痛，乳腺癌初起，跌打损伤的作用。落叶松脂醇从丝毛瑞香提取得到。
[0009] 本发明人通过研究落叶松脂醇对树突状细胞的调控作用，对落叶松脂醇的药理作用进行了研究，发现落叶松脂醇可参与对DC增殖分化及免疫刺激能力的抑制作用，且能促进抑炎性细胞因子IL-10的分泌。另外，还通过动物实验考察了落叶松脂醇对自身免疫病和移植排斥的预防和作用。基于上述药理作用，拟开发落叶松脂醇制备免疫抑制剂。
发明内容
[0010] 本发明所要解决的技术问题在于研究落叶松脂醇对树突状细胞的调控作用，设计制备其在抗自身免疫病和抗移植排斥免疫病的药物。
[0011] 本发明提供了落叶松脂醇在制备抗自身免疫病和抗移植排斥疾病药物中的应用。[0012] 本发明人对落叶松脂醇的药理作用进行了研究还通过动物实验考察了落叶松脂醇对自身免疫病和移植排斥的预防和作用。通过对健康人外周血树突状细胞(DC)的
分离和培养，落叶松脂醇对人树突状细胞分泌(白细胞介素10)的影响，结果显示落叶松脂醇刺激组及未刺激组体外单个核细胞转化树突状细胞分泌IL-10的浓度为2000±22pg/ ml，1200±14pg/ml，相差有显著性差距(P＜0.01)。对于落叶松脂醇作用前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力的比较，发现落叶松脂醇作用后DC对促同种异体T细胞增殖的能力明显低于未经落叶松脂醇刺激DC细胞促增殖的能力。MTT(四甲基偶氮唑蓝)还原法检测发现落叶松脂醇体外抑制人突状细胞增殖，腹腔注射检测落叶松脂醇
对EAE(实验性自身免疫病脑脊髓膜炎)的预防作用，结果发现，落叶松脂醇腹腔注射组小鼠的平均临床得分和脊髓单核细胞浸润明显低于未注射组。检测落叶松脂醇对小鼠心脏移植排斥的抑制作用，发现落叶松脂醇腹腔注射组小鼠的心脏存活天数明显高于未注射组。检测落叶松脂醇对迟发型超敏反应的抑制作用，发现落叶松脂醇腹腔注射组小鼠的耳片肿胀度明显低于未注射组。体内和体外的结果，均显示了落叶松脂醇可用于制备抗自身免疫病和抗移植排斥疾病药物。
[0013] 本发明所述药物为由落叶松脂醇作为活性成分与药用载体组成的制剂。根据不同用途可制成不同规格的口服剂型、注射剂、栓剂或外用剂型等。
[0014] 药用载体可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤癣醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。
[0015] 所述的自身免疫病和移植排斥疾病包括但不限于：慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖性糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合症、天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合症、硬皮病、结节性多动脉炎、Weganer肉芽肿病、重症肌无力、类风湿性关节炎、肾炎、肾病综合症、药物性皮炎、荨麻疹、日光性皮炎、过敏性休克或哮喘等自身免疫病或自身免疫反应相关性疾病；以及心脏、肝脏、肾脏、肺、皮肤、骨髓等器官移植时发生的急性、亚急性或慢性移植排斥反应性疾病。
[0016] 落叶松脂醇的有效量可根据病人的状态或体重，剂型，给药途径和使用周期的变化而变化，可由本领域的普通技术人员决定。
[0017] 本发明使用的落叶松脂醇可以市购，也可以从瑞香科植物丝毛瑞香中提取，还可以用化学合成法制备。
[0018] 本发明所述药物用于自身免疫病和移植排斥性疾病时，可以单独使用也可以和目前临床上已经批准使用的或今后批准使用的的药物和方法联合使用。其使用方法包括但不限于：直接体内使用或处理细胞后，做细胞的过继使用等。用于自身免疫病和移植排斥性疾病时的使用，可以是保护性或预防性以及有疗效的或减轻疾病的，包括处于疾病危险中或疑似已经发生疾病的患者以及患病或已经被诊断为患有疾病或医学病症的患者。
[0019] 在本发明中，术语“(Treatment或Treat)”指的是保护性或预防性以及有疗效的或减轻疾病的，包括处于疾病危险中或疑似已经发生疾病的患者以及患病或已经被诊断为患有疾病或医学病症的患者。
[0020] 本发明将用于制备抗自身免疫疾病和抗移植排斥免疫疾病药物，能有效抑制自身免疫病的发生和发展，延长移植物的存活时间，同时减少不良反应，并且落叶松脂醇来源丰
富，节约费用，有较大的临床应用价值。
附图说明
[0021] 图1落叶松脂醇促进人树突状细胞分泌IL-10
[0022] **表示：t检验时，p值＜0.01，显示该促进作用有统计学差异
[0023] 图2落叶松脂醇抑制DC对同种异体T细胞增殖的抑制作用
[0024] **表示：t检验时，p值＜0.01，显示该抑制作用有统计学差异
[0025] 图3落叶松脂醇体外抑制人突状细胞增殖
[0026] *表示：t检验时，p值＜0.05，
[0027] **表示：t检验时，p值＜0.01，显示该抑制作用有统计学差异
[0028] 图4落叶松脂醇抑制小鼠EAE的临床得分和单核细胞的脊髓浸润程度
[0029] *表示：t检验时，p值＜0.05，显示其EAE的严重程度临床得分有统计学差异；[0030] 曲线表示两面针碱腹腔注射降低EAE的临床严重程度
[0031] 黑点指示单核细胞的浸润程度
[0032] 图5落叶松脂醇抑制DNFB诱导的耳肿胀程度
[0033] **表示：t检验时，p值＜0.01，显示落叶松脂醇对小鼠耳肿胀的抑制程度有统计学差异
具体实施方式
[0034] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的技术手段。
[0035] 下列实施例使用的落叶松脂醇是实施例1制备得到。人外周血来自长海医院血站。C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠均购自上海必凯生物公司。所用其它试剂均可市售得到。另外，落叶松脂醇亦可以市购，还可用化学合成法制备，此处未采用。
[0036] 实施例1落叶松脂醇的制备
[0037] 将丝毛瑞香干燥茎皮50Kg粉碎，以80％乙醇400L回流提取3次，每次3小时，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水50L稀释后以乙酸乙酯萃取，每次50L，共3次，得到乙酸乙酯部位1600g。将上述乙酸乙酯部位应用硅胶柱层析，以体积比为100∶0～1∶1的石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有落叶松脂醇的流分，再经葡聚糖凝胶层析，以体积比为1∶1的氯仿/甲醇洗脱，得到纯的落叶松脂醇化合物2.15g，。[0038] 实施例2人树突状细胞体外培养和落叶松脂醇对DC的处理
[0039] 静脉抽取健康成人外周血50ml/人，肝素抗凝，利用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，以含10％小牛血清的RPMI1640(1640培养基)悬浮细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，加入24孔培养板中，0.5ml/孔，37℃，5％CO2孵箱培养2小时，使其中的单核细胞贴壁，温热的无血清RPMI1640轻洗培养板以去除贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞。在培养板中加入含rhGM-SCF(人重组颗粒单核细胞集落刺激因子)1000IU/ml、rhIL-4(人重组白细胞介素4)800IU/ml的含血清RPMI 1640，37℃，5％CO2孵箱培养5天，加入终浓度为4μmol/L的落叶松脂醇处理24小时后，加入终浓度为1000ng/ml的LPS(细菌脂多糖)继续刺激24小时。
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