(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010634393.7
(22)申请日 2020.07.04
(71)申请人 浙江工业大学
地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路
18号
(72)发明人 唐岚 张冉 何峥 单伟光
张振海
(74)专利代理机构 杭州赛科专利代理事务所
(普通合伙) 33230
代理人 吴琰
(51)Int.Cl.
A61K 31/355(2006.01)
A61K 31/704(2006.01)
A61K 9/51(2006.01)
A61K 47/42(2017.01)
A61P 35/00(2006.01)B82Y 5/00(2011.01)
(54)发明名称
方法和应用
(57)摘要
具体涉及一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒(V E S ‑D O X ‑
本发明提供的VES ‑DOX ‑BSANPs是以牛血清白蛋
白(BSA)作为载体材料，再通过包裹药物阿霉素
(DOX)和维生素E琥珀酸酯(VES)，采用高压均质
法制备得到VES ‑DOX ‑BSANPs。所述复合型阿霉素
白蛋白纳米粒具有大小均匀、粒径合适、分散性
较好、理化性质稳定的优势。在体内外药效实验
中，VES ‑DOX ‑BSANPs具有增效减毒和逆转肿瘤多
药耐药的作用。权利要求书1页 说明书9页 附图4页CN 111939151 A 2020.11.17
C N 111939151
A
1.一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒，其特征在于，所述纳米粒是由脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯溶于有机溶剂中作为有机相，含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相，在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳，经高压均质后去除有机溶剂获得。
2.一种权利要求1所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取一定量的脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯溶于有机溶剂中作为有机相，以含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相；
(2)在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳；
(3)将初乳置于高压均质机中，在一定的均质压力下多次循环后得到包裹阿霉素和维生素E琥珀酸酯的纳米粒混悬液，除去有机溶剂，即得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒混悬水溶液。
3.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述脱盐阿霉素的制备方法为，盐酸阿霉素加入纯化水中超声溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH 值为8～8.5，用氯仿萃取后减压浓缩除去氯仿，得到脱盐阿霉素。
4.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱盐阿霉素的投料量为5-10mg/mL有机相，脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1：1-3，有机溶剂为氯仿。
5.根据权利要求4所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水相中的牛血清白蛋白BSA含量为3-10mg/mL水相；所述步骤(1)中水相的水溶液为纯化水或氯化钠水溶液；水相与有机相体积比为40:1。
6.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中在高剪切乳化机的剪切条件下将有机相加入水相后，继续剪切5min形成初乳并过100目筛网。
7.根据权利要求6所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中均质压力为900-1300bar，循环次数为7-9次。
8.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱盐阿霉素DOX的投料量为10mg/mL有机相，脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES的投料摩尔比为1︰1，有机溶剂为氯仿，水相的水溶液为纯化水，水相与有机相的体积比为40︰1，水相的牛血清白蛋白BSA含量为5mg/mL水相；所述步骤(3)中均质压力为1100bar，循环次数为7次。
9.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液于低温冰箱中预冻后取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥，得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES -DOX -BSANPs冻干粉。
10.一种权利要求1所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒在抗肿瘤方面的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 111939151 A
一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
[0002]癌症长久以来一直是困扰人类健康问题的疾病，其复杂性、多变性和难治愈性，一直是药学研究、临床研究的难点和热点。在过去的几十年里，癌症取得了巨大的进展。在众多的方法中，化疗因药物对癌细胞的高细胞毒性成为大多数癌症的主要策略，然而传统的化疗药物如阿霉素(Dox orubicin，DOX)总是表现出固有的局限性，如非特异性分布、毒性大、生物利用度差、血液清除快和在生理环境中溶解度差等。
[0003]DOX属于一种蒽环类抗肿瘤抗生素，由链霉菌青灰亚种衍生而成，是一类具有广泛活性的化学药物。DOX与快速分裂的细胞作斗争，并阻碍肿瘤细胞的生长，这些特性使其作为一种非常重要的化疗药物而享有盛誉，尽管DOX已被标准化为抗癌一线药物，其耐药性和毒副作用仍然是其临床应用的重要限制因素，其潜在的心脏毒性，包括危及生命的心肌疾病、充血性心力衰竭以及剂量限制性的骨髓抑制作用是必须考虑的副作用。
[0004]纳米粒(Nanoparticles，NPs)通常被定义为1～1000nm之间的胶体聚合物粒子，是药物的良好载体，与微球类载体的主要区别是其具有超微小体积，它能穿透组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管，因而作为新的药物载运系统被广泛研究，特别是在靶向和定位给药、粘膜吸收给药、基因和蛋白多肽类药物控释等领域，纳米粒独具优越性。
[0005]白蛋白是一种简单蛋白质，其分子中氨基酸以肽键相连接，并且扭曲成团状，具有无数的网状空隙，为镶嵌携带药物创造了有利的空间条件。动物病理学研究表明，牛血清白蛋白BSA可作为安全无毒的载体，静脉注射白蛋白微球广泛地用于诊断，未见有毒性地相关报道。白蛋白还具有生物可降解性，当药物与白蛋白结合后，可阻止药物从注射部位释放，使药物在有效部位缓慢释放。以白蛋白作为载体
的纳米粒无毒、生物相容性较好，它能够利用天然白蛋白的途径，比如gp60和小窝蛋白介导的跨细胞转运和肿瘤SPARC蛋白之间的相互作用来达到药物的肿瘤靶向。综上所述，牛血清白蛋白属于一种理想的药物载体。[0006]白蛋白纳米粒给药系统包括主动靶向和被动靶向。未经表面修饰的纳米粒通过静脉给药进入机体后，主要被网状内皮细胞丰富的脏器所摄取。纳米给药系统进入机体后的分布主要受纳米粒的表面性质及粒径的影响。表面带正电的纳米粒一般具有肺组织靶向性，表面带负电荷的纳米粒具有肝组织靶向性。白蛋白纳米粒主动靶向系统有纳米粒表面修饰、磁性白蛋白纳米粒和通过抗原-抗体相结合的白蛋白纳米粒。纳米粒表面修饰，是通过共价偶联作用，改变纳米粒的表面性质，从而可以避免被肝脏、脾脏等巨噬细胞吞噬，而具有靶向性；磁性白蛋白纳米粒，即用白蛋白将药物及磁性物质(如四氧化三铁、三氧化二铁等)包载后制备纳米粒，给药后通过外界磁场的控制使磁性白蛋白纳米粒移至靶组织或靶器官。
[0007]白蛋白纳米粒的制备方法主要可以分为乳化固化法、去溶剂化法、Nab TM技术及其他方法。
[0008]维生素E琥珀酸酯(Vitamin E succinate，VES)抗肿瘤作用广泛，同时对正常人体细胞及组织没有毒副作用，目前众多研究验证了VES对胃癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌等均有较好抑制效果。VES能够通过活氧簇ROS来诱导细胞凋亡，由于肿瘤细胞内pH比正常细胞低，使得VES可以选择性的抑制肿瘤细胞而对正常组织无不良作用。
[0009]VES抗肿瘤作用机制在于以下两个方面：(1)抑制肿瘤细胞增殖，肿瘤细胞因细胞周期紊乱而造成无限制增殖，VES抑制肿瘤细胞增殖主要通过抑制DNA的合成、阻滞细胞周期、调节细胞周期调控蛋白等机制来实现；(2)诱导肿瘤细胞凋亡，VES诱导肿瘤细胞凋亡主要通过内源性通路和外源性通路实现。
发明内容
[0010]本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒(VES-DOX-BSANPs)及其制备方法和其在抗肿瘤方面的应用。为降低DOX的毒副作用，增强疗效，逆转肿瘤的多药耐药性，本发明选择同时具有抗肿瘤和抗耐药作用的VES和阿霉素制备一种复合型纳米粒并用于癌症的。通过将DOX和VES联合用药，制备合适粒径的纳米粒，起到较好的肿瘤靶向作用，降低阿霉素的毒副作用并增强抗肿瘤作用。
[0011]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0012]本发明的目的之一是提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs，所述纳米粒是由脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES溶于有机溶剂中作为有机相，含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相，在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳，经高压均质后去除有机溶剂获得。
[0013]本发明的另一目的是提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs的制备方法，包括如下步骤：
[0014](1)称取一定量的脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES溶于有机溶剂中作为有机相，以含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相；
[0015](2)在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳；
[0016](3)将初乳置于高压均质机中，在一定的均质压力下多次循环后得到包裹DOX和VES的纳米粒混悬液，除去有机溶剂，即得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs混悬水溶液。
[0017]优选的，所述方法步骤在避光下进行。
[0018]优选的，所述脱盐阿霉素DOX的制备方法为，精密称取适量DOX·HCl，加入一定量的纯化水，超声10min使其充分溶解，加入氢氧化钠水溶液调节pH值为8～8.5，用氯仿萃取，取氯仿层，用饱和食盐水萃取，除去未游离出的DOX·HCl，氯仿溶液加入过量无水硫酸钠除去水分，35℃减压浓缩除去氯仿，得到脱盐DOX。
[0019]优选的，所述步骤(1)中脱盐DOX和VES的投料摩尔比为1：1-3，更优选的投料摩尔比为1:1。
[0020]优选的，所述步骤(1)中，有机相中脱盐阿霉素DOX的投料量为5-10mg/mL有机相，更优选的投料量为10mg/mL。
[0021]优选的，所述步骤(1)中，水相中的牛血清白蛋白BSA含量为3-10mg/mL水相，更优选的含量为5mg/mL。
[0022]优选的，所述步骤(1)中有机溶剂为氯仿；水相的水溶液为纯化水、1％氯化钠水溶液、2％氯化钠水溶液或3％氯化钠水溶液，更优选的水溶液为纯化水。
[0023]优选的，所述步骤(1)中有机相与水相体积比为1:40。
[0024]优选的，所述步骤(2)中在高剪切乳化机的剪切条件下将有机相加入水相。[0025]优选的，所述步骤(2)中有机相加入水相后继续剪切5min形成初乳。
[0026]优选的，所述步骤(2)中有机相和水相形成初乳后过100目筛网。
[0027]优选的，所述步骤(3)中均质压力为900-1300bar，循环次数为7-9次；更优选的均质压力为1100bar，循环次数为7次。
[0028]优选的，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液于低温冰箱中预冻后取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥，得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs冻干粉
[0029]优选的，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液放入-80℃低温冰箱中预冻12h，随后将预冻样品取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥24h后，得到VES-DOX-BSANPs冻干粉。
[0030]本发明的另一目的是提供一种所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs 在抗肿瘤方面的应用。
[0031]本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：
[0032](1)本发明所述的VES-DOX-BSANPs以BSA为载体，采用了高压均质法制备白蛋白纳米粒，高压均质法与传统制备方法相比，不需添加表面活性剂或任何聚合物，药理活性物质以非晶体、无定型状态存在，可以得到分散均匀且粒径合适的纳米粒。
[0033](2)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在体外毒性试验中，表明VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR有较强的细胞生长抑制作用，其毒性强于DOX原料药。计算耐药指数和逆转耐药因子，证明VES不仅有很强的抗肿瘤作用，还有对MCF-7/ADR的抗耐阿霉素药的良好作用。DOX和VES的协同实现了对耐药株的抑制，更能有效的杀死耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)。[0034](3)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在荷瘤鼠体内的药效学试验研究结果显示，与其它给药组相比，VES-DOX-BSANPs组体内抑瘤效果最强。
[0035](4)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在荷瘤鼠体内，能更好地靶向肿瘤组织，起到增强疗效，降低毒副作用的效果。
[0036]因此，本发明所述的复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs具有避免了有毒有机溶剂的残留、逆转肿瘤对DOX的多药耐药性、更好的肿瘤靶向性的作用，从而能够增强疗效，降低DOX的毒副作用。
附图说明
[0037]图1 VES-DOX-BSANPs的TEM图；
[0038]图2 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对MCF-7细胞的生长抑制效果图(n＝5)；[0039]图3 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR细胞的生长抑制效果图；[0040]图4 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对4T1细胞的生长抑制效果图；
[0041]图5为各组小鼠肿瘤体积在给药期间的变化图；
[0042]图6为各组小鼠肿瘤解剖图；
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