(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510739801.4
(22)申请日 2015.11.04
A01H 4/00(2006.01)
(71)申请人广西相成生物科技有限公司
地址530000 广西壮族自治区南宁市华侨投
资区宁武农场雷诺生产基地
(72)发明人苏钰琴 黄云峰 杨杰花 莫燕兰
蒋珍藕 盘飞兰 韦祥意 罗文正
秦丹欣 张华英
(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理
事务所(普通合伙) 11371
代理人
栾波
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及植物栽培技术领域，具体而言，涉
及一种金毛狗脊孢子组培繁育方法，包括以下步
骤：1)、采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊并
中培养至孢子萌发；3)、将萌发出的组织转接到
金毛狗脊增殖培养基中培养，诱导丛生原叶体的
生成；4)、将原叶体转接到新的金毛狗脊分化培
养基中培养，诱导分化成幼孢子体；5)、将幼孢子
体转接到金毛狗脊生根培养基中培养成孢子体。
该培养方法可用于金毛狗脊的快速繁育，可以得
到大规模的整齐种苗，且繁殖系数高，解决了金毛
狗脊无法规模化繁育的问题。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图4页CN 105230492 A 2016.01.13
C N 105230492
A
1.一种金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊并消毒；
2)、将孢子囊接种到金毛狗脊萌发培养基中培养至孢子萌发；
3)、将萌发出的组织转接到金毛狗脊增殖培养基中培养，诱导丛生原叶体的生成；
4)、将原叶体转接到新的金毛狗脊分化培养基中培养，诱导分化成幼孢子体；
5)、将幼孢子体转接到金毛狗脊生根培养基中培养成孢子体。
2.根据权利要求1所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，在步骤2)中，所述金毛狗脊萌发培养基包括改良MS培养基、N
6
培养基、Pragre培养基。
3.根据权利要求2所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，所述金毛狗脊萌发培养基中还包括如下原料组份：
6-BA 0～0.3mg/L、NAA 0～0.2mg/L。
4.根据权利要求2或3所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，在步骤3)～
5)中，所述金毛狗脊增殖培养基、金毛狗脊分化培养基及金毛狗脊生根培养基均为改良1/2MS培养基；所述的改良1/2MS培养基中还包括如下原料组份：6-BA 0～1.0mg/L、NAA 0～1.0mg/L。
5.根据权利要求4所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，所述改良MS培养
基中的改良成分为：KNO
3调整为800～900mg/L，NH
4
NO
3
调整为700～800mg/L；
所述改良1/2MS培养基是通过将改良MS培养基的大量元素减半而其他组份的含量不变而配制的培养基。
6.根据权利要求5所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，所述改良MS培养基和改良1/2MS培养基中包括如下原料组份：
琼脂4～5g/L，蔗糖20～35g/L，活性炭0～0.3g/L。
7.根据权利要求6所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，所述改良MS培养基和改良1/2MS培养基的pH均为5～6。
8.根据权利要求7所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于：
在步骤2)中，所述培养的培养时间为20～35天；
在步骤3)中，所述培养的培养时间为30～40天；
在步骤4)中，所述培养的培养时间为20～30天；
在步骤5)中，所述培养的培养时间为30～40天。
9.根据权利要求1所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中，具体包括：
对培育出的原叶体进行增殖，增殖倍数为5～10倍；再将增殖好的原叶体转接到金毛狗脊分化培养基中培养，诱导分化成幼孢子体。
10.根据权利要求1所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，其特征在于，在所述培养的过程中，培养条件为：
光照强度1000～1500lx、光照时间7～9小时/天、培养温度23～25℃，培养湿度65～70％。
一种金毛狗脊孢子组培繁育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物栽培技术领域，具体而言，涉及一种金毛狗脊孢子组培繁育方法。
背景技术
[0002] 金毛狗脊(Cibotium barometz(L.)J.Sm.)为蕨类蚌壳蕨科植物，主产于广西，在广东、贵州、江西、东南亚一带也有分布，为国家II级保护植物。
[0003] 狗脊是金毛狗脊的干燥根茎，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝等作用，历年版《中国药典》均有收载。壮医、瑶医常将其用于风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力等疾病；壮族、瑶族人民常将其配以肉、骨类食品煲汤饮用、用根茎烹茶饮用，以嫩叶炒菜食用，滋补防病、享受美味。其根茎外面生长的金黄柔毛用于外伤止血。现代研究发现：金毛狗脊具有抗骨癌、防治骨质疏松、止血、镇痛、抑菌、抗炎等功效，是国内多家著名制药企业用于生产壮腰健肾丸、活血应痛丸、壮骨关节丸、金鸡虎补丸、金毛狗脊酒等近百个中成药的主要原料。[0004] 由于加工企业对药材的需求量不断增加，导致民间疯狂采挖，野生资源日见稀少，中国已明令禁止采挖野生资源，并加大了处罚力度，越南等国也严控金毛狗脊的出口，药材供需矛盾十分突出。因此，开展金毛狗脊的人工种植，已成燃眉之急。
[0005] 在人工种植金毛狗脊的各个环节，最突出的矛盾是如何繁育出高性价比的种苗。前人对金毛狗脊栽培方法进行了研究，使用根状茎切段繁殖种苗，获得了种苗繁育方法，但要浪费大量药材，而且采集野生资源违法，育苗成本高，没有进行推广；有实验表明金毛狗脊孢子在人工环境繁殖系数低；由此可见，当前传统技术手段连金毛狗脊的成功繁殖都难以保证，遑论解决金毛狗脊种苗规模化繁育及成本控制问题。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种金毛狗脊孢子组培繁育方法，所述的培养方法可用于金毛狗脊的快速繁育，解决了金毛狗脊无法规模化繁育的问题。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] 一种金毛狗脊孢子组培繁育方法，包括以下步骤：
[0009] 1)、采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊并消毒；
[0010] 2)、将孢子囊接种到金毛狗脊萌发培养基中培养至孢子萌发；
[0011] 3)、将萌发出的组织转接到金毛狗脊增殖培养基中培养，诱导丛生原叶体的生成；
[0012] 4)、将原叶体转接到新的金毛狗脊分化培养基中培养，诱导分化成幼孢子体；[0013] 5)、将幼孢子体转接到金毛狗脊生根培养基中培养成孢子体。
[0014] 蕨类植物具有明显的世代交替，从单倍体的孢子开始，到配子体上产生出精子和卵，这一阶段为单倍体的配子体世代(亦称有性世代)，从受精卵开始，到孢子体上产生的孢子囊中孢子母细胞在减数分裂之前，这一阶段为二倍体的孢子体世代(亦称无性世代)。这两个世代有规律地交替完成其生活史。本申请所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法就是适
应蕨类植物的这种世代交替的特性所设计的。
[0015] 其中，在步骤1)中，由于金毛狗脊的孢子粉非常细小，收集后无法进行消毒灭菌。因此只能在孢子成熟、且孢子囊没有打开时连同孢子囊一起采集，进行消毒灭菌。消毒方法为，用0.1％溶液或5％次氯酸钠溶液进行消毒8～10min；
[0016] 在步骤2)中，孢子囊接种到金毛狗脊萌发培养基中的目的是诱导萌芽。可用夹子将孢子囊夹碎，使孢子粉散落在金毛狗脊萌发培养基中进行培养；或是将消毒灭菌好的孢子囊放在超净工作台上，用无菌滤纸垫好，打开孢子囊，使孢子粉掉落到滤纸上，再将滤纸上的孢子粉接种到金毛狗脊萌发培养基中进行培养；
[0017] 在步骤3)中，将从孢子囊中萌发出的组织转接到金毛狗脊增殖培养基中培养的主要目的是将孢子培育为原叶体；
[0018] 步骤4)的目的是将原叶体诱导培养为幼孢子体；
[0019] 步骤5)是诱导幼孢子体进一步成长并生根，为其今后移栽做准备。
[0020] 以上步骤的操作均优选在超净工作台上进行。
[0021] 该组培繁育方法简单易行，便于操作，可用于金毛狗脊的快速繁育。本发明采用孢子进行组培繁育，只需要采集金毛狗脊孢子叶上成熟的孢子囊即可进行繁育，对母体没有伤害，不影响整个植株的生
长。此外，本发明具有组培方法固有的培育出无病毒种苗的特点，繁育出的金毛狗脊苗健壮，成活率高，获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化育苗管理和规模化栽培。
[0022] 如上所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，在步骤2)中，所述金毛狗脊萌发培养基
培养基、Pragre培养基。
包括改良MS培养基、N
6
[0023] 优选的，所述金毛狗脊萌发培养基中还包括如下原料组份：
[0024] 6-BA 0～0.3mg/L、NAA 0～0.2mg/L。
[0025] 优选的，如上所述的金毛狗脊孢子组培繁育方法，在步骤3)～5)中，所述金毛狗脊增殖培养基、金毛狗脊分化培养基及金毛狗脊生根培养基均为改良1/2MS培养基；如上所述的三种培养基中还包括如下原料组份：6-BA 0～1.0mg/L、NAA 0～1.0mg/L。[0026] 表1改良MS培养基母液配制示例(单位：mg)
[0027]
[0028] 在步骤2)中，优选的改良MS培养基的作用是诱导金毛狗脊孢子萌芽；在步骤3)～5)中，培养基的作用是诱导萌芽的孢子形成丛生原叶体、诱导丛生原叶体分化成幼孢子体、幼孢子体培养成可移栽的孢子体。此外，采用改良1/2MS培养基也可以有效降低后期培养的成本。
[0029] 其中，MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，但是，高盐离子浓度反而不利于金毛狗脊原叶体分化成孢子体。因此，本申请对
其中大量元素中的KNO
3及NH
4
NO
3
含量进行改良，其具体含量如表1所示。
[0030] 改良MS培养基的配制方法简述如下：
[0031] 取1000mL烧杯一只，先加入600mL的蒸馏水，再依次加入大量元素母液100mL，微量元素母液10mL，铁盐母液10mL，钙盐母液100mL，有机物质母液20mL，蔗糖若干，待蔗糖充分溶解后，加入琼脂粉及活性炭若干。
[0032] 把盛有培养基的烧杯放在电磁炉上加热，将琼脂完全融化(可在此时加入6-BA及NAA，并调节pH)，最后定容到1000mL。定容后分装、包裹并高温灭菌；灭菌后培养基冷却，凝固才能使用。
[0033] 其中，6-BA(6-Benzylaminopurine)，即6-苄氨基腺嘌呤，属广谱性植物生长调节剂，具有促进植物细胞生长与分裂，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等功能。
[0034] NAA(1-Naphthaleneacetic acid)，即萘乙酸，属广谱型植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根等功能。
[0035] 优选的，所述改良MS培养基中将KNO3调整为800～900mg/L，NH4NO3调整为700～800mg/L；
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