(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510712786.4
(22)申请日 2015.10.27
C12N 7/04(2006.01)
C12N 15/63(2006.01)
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人广东和信健康科技有限公司
地址510530 广东省广州市萝岗区瑞发路1
号1栋4楼
申请人广州呼研所生物技术有限公司
(72)发明人李小锋 李晨阳 崔红 商兴芳
(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人
万志香 胡杰
(54)发明名称
(57)摘要
乙型流感病毒和β-actin 三种碱基片段串联而
了上述假病毒颗粒的制备方法和其作为甲型流感
病毒、乙型流感病毒检测的质控品的应用。本发明
的假病毒颗粒制备方法简单、操作容易、获得的假
病毒纯度高，可作为甲型流感病毒及乙型流感病
毒核酸检测试剂盒中的质控品，无传染性且稳定
性好，具有耐核糖核酸酶等特点。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书16页序列表4页 附图3页CN 105200018 A 2015.12.30
C N 105200018
A
1.一种假病毒颗粒，其特征在于，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:3或对SEQ ID NO:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述乙型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:4或对SEQ ID NO:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述β-actin的碱基片段为SEQ ID NO:5或对SEQ ID NO:5进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
5.一种假病毒颗粒的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)使用针对MS2噬菌体基因组的引物，以MS2噬菌体基因为模板，进行RT-PCR扩增得到产物，该扩增产物包含MS2噬菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列；
(2)将扩增产物插入原核表达载体pSE380中，构建重组质粒pSE380-MS2；
(3)将所得到的重组质粒pSE380-MS2转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；
(4)得到含有依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的核苷酸序列，该核苷酸序列的两端带有限制性内切酶BglII和HindIII的酶切位点；
(5)将步骤(4)所得到的核苷酸序列与重组质粒pSE380-MS2进行连接，构建重组质粒pSE380-MS2-AB；
(6)诱导重组质粒pSE380-MS2-AB的表达与纯化，即得。
6.根据权利要求5所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤(1)中针对MS2噬菌体基因组的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
7.根据权利要求5所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤(4)为：用扩增引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以SEQ ID NO:6为模板进行扩增，得到的扩增产物即为所述核苷酸序列。
8.根据权利要求5-7任一项所述的假病毒颗粒的制备方法，其特征是，步骤(6)中的诱导表达与纯化包括以下步骤：
(6.1)、将pSE380-MS2-AB重组质粒的阳性菌落，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平板；
(6.2)、挑取单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中；
(6.3)、培养至A600nm为0.5-1.0时，加入IPTG，诱导表达形成病毒颗粒；
(6.4)、采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I 将裸露的RNA与DNA降解；
(6.5)、离心收集上清，鉴定，将鉴定正确的病毒样颗粒保存。
9.权利要求1-4任一项所述的假病毒颗粒作为甲型流感病毒和/或乙型流感病毒检测中的外标质控品的应用。
10.一种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括有检测试剂和外标质控品，所述外标质控品为权利要求1-4任一项所述的假病毒颗粒。
一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于病原体体外诊断技术领域，具体涉及一种假病毒颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 随着分子生物学技术的迅速发展，以聚合酶链式反应为基础的各种分子生物学诊断技术，因其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，方便快捷等优点，成为生物医学领域内最有价值的研究手段，已经广泛应用于临床标本的检测。在RNA病毒RT-PCR检测中，实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂问题等，均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。核酸扩增检测想得到可靠的结果，必须使用质控品进行严格的质量控制，即需要特定的质控品。质控物须具备以下特点：(1)容易制备；(2)在贮存和使用过程中稳定性好；(3)无生物传染性；(4)能监控整个检测过程，结果可靠。
[0003] 造成人间流感流行的病毒主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒。甲型和乙型流感病毒均属正粘病毒科，其基因组都是由8节段的负链单股RNA组成。其结构主要由三部分组成：1.核心：位于病毒最内层，由核酸和核蛋白组成。2.基质蛋白(M蛋白)：位于病毒脂质包膜下，并与膜结合的蛋白。3.包膜：位于基质蛋白之外的双层脂质，来源于宿主细胞膜，其包含有两种重要的糖蛋白，具有重要的抗原性：即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。依据HA和NA蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。流感病毒可感染呼吸道的所有各类细胞，并能在其内复制，其致病的主要机制是病毒复制引起的细胞损伤及死亡。
[0004] 由于天然病毒潜在的传染危险性及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品如灭活的病毒颗粒、cDNA、质粒DNA、裸露的RNA以及体外转录RNA，都难以达到试验要求，所以研制稳定的、无生
物传染性的质控品，不但对RNA病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。
[0005] 病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，但可以组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，具有很强的免疫原性及很好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样颗粒与重组质粒DNA 融合，转录成的重组RNA包入病毒样颗粒内，即形成假病毒。假病毒具有模拟真病毒结构、能够抵抗核酸酶降解、稳定、安全性高等优点，给目前RNA病毒检测研究工作提供了一种强有力的工具。MS2噬菌体是单链正链RNA病毒，为26nm长的20面体，共有3569个核苷酸，包含有3个基因，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子。噬菌体由180个包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成，在MS2噬菌体包膜蛋白的研究中发现包膜蛋白与噬菌体复制酶5’端由19个碱基(19,mer)组成的茎环结构RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。
发明内容
[0006] 本发明需要解决的技术问题是提供了一种含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种检测片段的假病毒颗粒；该假病毒具有模拟真病毒结构、能够抵抗核酸酶降解、稳定、安全性高等优点，并且易于制备、保存和运输，可作为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒中质控品。该方法具有快速、客观准确等技术效果。
[0007] 解决上述技术问题的技术方案如下。
[0008] 一种假病毒，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。
[0009] 在其中一个实施例中，所述甲型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:3或对SEQ IDNO:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
[0010] 在其中一个实施例中，所述乙型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:4或对SEQ IDNO:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
[0011] 在其中一个实施例中，所述β-actin的碱基片段为SEQ ID NO:5或对SEQ ID NO:5进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种上述假病毒的制备方法。
[0013] 实现该目的的技术方案如下。
[0014] 一种上述假病毒的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)设计针对MS2噬菌体基因组的引物，进行RT-PCR扩增得到约1780bp的产物，包含MS2噬菌体的包膜蛋白基因、成熟酶基因、包装信号序列；
[0016] (2)将扩增产物插入原核表达载体pSE380中，构建重组质粒pSE380-MS2；[0017] (3)将所得到的重组质粒pSE380-MS2转化入大肠杆菌感受态细胞中，扩大培养，提取质粒；
[0018] (4)得到含有依次由甲型流感病毒、乙；型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的核苷酸序列，该核苷酸序列的两端带有限制性内切酶BglII和HindIII的酶切位点；
[0019] (5)将步骤(4)所得到的核苷酸序列与重组质粒pSE380-MS2进行连接，构建重组质粒pSE380-MS2-AB；
[0020] (6)诱导重组质粒pSE380-MS2-AB的表达与纯化；即得。
[0021] 在其中一个实施例中，步骤(1)中针对MS2噬菌体基因组的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0022] 在其中一个实施例中，步骤(4)为：用扩增引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，以SEQ ID NO:6为模板进行扩增，得到的扩增产物即为所述核苷酸序列。
[0023] 在其中一个实施例中，步骤(6)中的诱导表达与纯化包括以下步骤：
[0024] 6.1、将pSE380-MS2-AB重组质粒的阳性菌落，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平板；
[0025] 6.2、挑取单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中；
[0026] 6.3、培养至A600nm为0.5-1.0时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，诱导表达形成病毒颗粒；
[0027] 6.4、采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，并加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I将裸露的RNA与DNA降解；
[0028] 6.5、离心收集上清，鉴定，将鉴定正确的病毒样颗粒保存。
[0029] 本发明的另一目的是提供上述假病毒的应用。
[0030] 实现上述目的的技术方案如下。
[0031] 上述假病毒作为甲型流感病毒和/或乙型流感病毒检测中的外标质控品的应用。[0032] 在其中一个实施例中，所述质控品为甲型流感和/或乙型流感病毒检测中的强阳性对照和临界阳性对照。
[0033] 本发明的另一目的是提供了一种甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试剂盒。
[0034] 实现上述目的的技术方案如下。
[0035] 甲型流感病毒和/或乙型流感病毒核酸检测试剂盒，包括有检测试剂和外标质控品，所述外标质控品为上述假病毒颗粒。
[0036] 本发明的另一实施例中，所述试剂盒的检测试剂包含核酸提取试剂，例如所述核酸提取试剂包含核酸提取液A、B、C及样本稀释液；核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包含Inf.A/Inf.B/β-actin扩增反应液，Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
[0037] 此外，还可以包括有使用说明书。
[0038] 所述外标质控品为强阳性对照，临阳性对照；强阳性对照，临阳性对照为上述假病毒颗粒。
[0039] 本发明设计了一种新的用于甲型流感病毒、乙型流感病毒的质控品的假病毒颗粒，该假病毒颗粒含有包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体，该含串联甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种检测片段的假病毒颗粒，经试验验证该病毒样颗粒具有以下几个方面的优点：1、无传染性，在制备和使用时对人员和环境均无危险；2、稳定性好，耐RNA酶；3、在进行核酸提取及PCR鉴定过程中可全程检测整个实验过程。本发明可作为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的质控品，具有很强的实用价值。
附图说明
[0040] 图1为实施例1中质粒pSE380的图谱；
[0041] 图2为实施例2中强阳性对照和临界阳性对照均匀性实验的荧光PCR检测结果；[0042] 图3为实施例3中强阳性对照和临界阳性对照稳定性试验的荧光PCR检测结果；[0043] 图4为实施例4中5份临床样本的第一次荧光PCR检测结果；
[0044] 图5为实施例4中5份临床样本的第二次荧光PCR检测结果。
具体实施方式
[0045] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0046] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议