中图分类号：Q93；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2006)01-0144-058
红曲的生产工艺及Monacolin K和桔霉素的检测 鲁佳慧，刘昕，王江海，袁建平
(中山大学国家教育部食品工程研究中心，广州510275) 摘要：综述红曲的生产工艺及Monacolin K和桔霉素的检测方法，指出采用新型生产工艺、优化发酵条件和应用菌种筛选等现代技术是生产既富含活性成分Monacolin K又不含桔霉素的功能性红曲的重要途径，同时预示Monacolin K和桔霉素检测技术的进展将为功能性红曲产品的质量、安全使用及国际市场的开拓提供技术支撑。 关键词：红曲；生产工艺；Monacolin K；桔霉素；检测
Production Techniques of Red Y east Rice and Determination of
Monacolin K and Citrinin
Lu Jia-hui, Liu Xin, Wang Jiang-hai, Yuan Jian-ping
(Food Engineering Research Center of State Education Ministry, Sun Y at-Sen University, Guangzhou 510275,China) Abstract: In this paper, we overviewed the production techniques of red yeast rice and analytical methods of monacolin K and citrinin. The important producing approaches of the functional red yeast rice of abundant monacolin K without citrinin included applying new techniques, optimizing fermentation parameters and screening strains. The improving of detecting techniques of monacolin K and citrinin can provide guarantee for its quality, security and international market.
Keywords: Red Y east Rice; Production Technique; Monacolin K; Citrinin; Determination
红曲是我国传统的发酵产品，长期应用于食品着及作为药用。1979年日本远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到了一系列可显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin类化合物，其中以Monacolin K 的活性最为显著。药理学研究和临床试验表明红曲能有效降低体内总胆固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，同时升高高密度脂蛋白水平，从而具有显著的降胆固醇及降血脂的作用[1~2]。
然而，真菌毒素桔霉素(Citrinin)的发现使功能性红曲的使用安全性受到了挑战。桔霉素是红曲菌的次生代谢产物，具有肾毒性，还可致畸、致癌和诱发基因突变等[3]。桔霉素的存在已成为我国功能性红曲应用和出口的瓶颈。因此，采用新型生产工艺、优化发酵条件、应用菌种筛选等现代技术，研发富含活性物质Monacolin K且不含桔霉素的功能性红曲必将成为生产功能性红曲技术革命的制高点。
1 功能性红曲的生产工艺
1.1 固态发酵
收稿日期：2005-09-07
作者简介：鲁佳慧，助工，药学硕士，研究方向为中药及天然药物研究
传统红曲生产工艺主要是以大米为固态培养基，接种红曲菌菌种后通过发酵生产红曲。该方法工艺落后，劳动强度大，红曲产量低，质量不稳定，并且易受杂菌污染。80年代后，通风池法应用于红曲的生产，红曲产量和质量相对提高。圆盘制曲机的应用实现了红曲的自动化生产，并提高了红曲质量，在一定程度上减少了杂菌污染。
传统红曲发酵工艺由于未能有效控制通风、温度、湿度等重要发酵条件，因此，所得红曲的价和活性成分较低，且桔霉素污染严重。刘昕[4]提出在固态发酵中，代谢产物Monacolin K在红曲菌菌丝体生长后期的积累达到最大。同时，由于淀粉质固态培养基料被红曲菌分泌的淀粉酶和糖化酶液化而出现基料通气环境恶化，菌丝体细胞壁被高渗透压葡萄糖液浸润，从而使其生长代谢出现变态反应，促使桔霉素的生成以抑制其它杂菌的生长。因此他提出了一种通过调控红曲菌培养过程中的培养温度、湿度及通风量来抑制桔霉素生成的方法，所获得的功能性红曲中Monacolin K含量高且未检测出桔霉素。
王立新等[5]认为固态发酵法较液体发酵法具有明显的优势。在确定的实验条件下，固态发酵法所得的
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Monacolin K产率为液体发酵法的20倍以上。因此在掌握固态发酵规律的基础上，设计合理的固态发酵反应系统，实现高效低耗的固态发酵生产，是功能性红曲产业化生产的有效途径。同时，该研究表明固态发酵过程中物料的初始含水量以50%为宜。含水量较高时，糖化酶活性增强，从而提高培养基料的糖化速率，不利于红曲中Monacolin K的积累。
培养温度对促进红曲菌发酵过程中Monacolin K 的生成十分重要。恒温培养可获得比变温培养更高收率的菌体量和素，而变温培养的Monacolin K产量更高。实验研究表明，在32°C温度下培养9 d后，将温度降至25°C下培养14 d，则更有利于Monacolin K 的积累[6]。
红曲为好气性菌，其菌丝体的生长和Monacolin K 等次生代谢产物的产生都需要有足够的氧气。因此，适宜的溶解氧水平是一个非常重要的参数，它直接影响红曲中Monacolin K和桔霉素的含量。提高通风量有利于菌体生成和Monacolin K的产生，但同时桔霉素的含量也增加。因此，在满足溶氧需求的情况下，可采用低通风量[7]。
固态发酵法是目前红曲生产中广泛采用的方法，具有投资少，产量大，生产经验丰富等优点。现代固态
发酵工艺的关键是控制发酵过程中菌种质量及物料含水量、通风量、培养温度及湿度等参数，通过现代技术优化和改造发酵工艺，可望有效生产富含活性成分Monacolin K且不含桔霉素的功能性红曲。
1.2 液态发酵
液态发酵法发酵红曲主要以淀粉、葡萄糖、甘油、黄豆粉、玉米浆和蛋白胨等为培养基，采用常规标准深层发酵设备，如机械搅拌发酵罐等。近年来开发的适宜于高粘度发酵体系的气升式反应器，将更加有利于发酵过程的进行。
液态发酵法培养基的碳源、氮源、初始pH值及溶氧量等是关键的工艺控制参数。碳源以甘油最好，葡萄糖次之。有机氮源中肉膏和蛋白胨优于酵母膏，无机氮源则以NaNO3较好。C/N比值是十分重要的控制因素，它不仅影响前期菌丝体的生长，而且对后期代谢产物的形成和积累也非常重要。实验结果表明，当C/N比为5:33时，Monacolin K的产量较高[8]。赵树欣等[7]认为培养基的初始pH值对Monacolin K的生成也有明显影响，当pH为6.0~6.5时最为适宜。
许赣荣等[9]对经过筛选低产桔霉素的一株红曲菌菌种进行液态发酵法培养，选用玉米淀粉和谷氨酸单钠盐为主要成分的培养液，所获得的红曲菌发酵液中桔霉素浓度低于1mg/ml。此外，溶氧条件对红曲菌产生桔霉素的影响的研究结果表明，高溶氧对桔霉素的产生有促进作用。
Blanc等[10]研究发现，在液态深层培养红曲的过程中添加6至18碳脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素的生成，尤其是辛酸和2-三十碳酮可使桔霉素的生成量减少75%。
杨胜利等[11]研究发现，应用超声波技术可提高红曲菌发酵过程中Monacolin K的产量。正常情况下红曲菌落呈团状，氧和营养物质不易吸收，也不利于代谢产物的生成。采用超声波处理可使菌丝体分散，甚至成为游离的单菌体，从而有利于菌体的代谢和活性物质的分泌。同时，超声波处理还可降低发酵液的粘度，有利于氧气和营养物质的传递。实验结果显示，当超声处理时间为2 min左右时其效果最佳，既不引起细胞死亡，又能显著提高Monacolin K的产量。
液态发酵法所用基质的混合和扩散较为均匀，有利于氧气和其它营养成分的传递与扩散，且易于添加某些特定成分以抑制桔霉素的生成。但目前国内采用液态深层发酵法生产的红曲发酵液中，Monacolin K 含量较低且不稳定，甚至出现依靠添加由土霉素发酵获得的Monacolin K或直接添加合成药物洛伐他丁来控制产量的现象。因此，红曲的液态发酵工艺及产品质量控制需进一步加以规范。
1.3 菌种筛选
通过菌种诱变筛选特异性菌种是提高红曲中Monacolin K含量，同时抑制桔霉素生成的另一重要途径。魏培莲等[12]对红曲菌出发菌株(Parent strain)进行紫外线、硫酸二乙酯、氯化锂等诱变剂反复诱变处理后，获得3株具有较强Monacolin K生产能力的菌株，其中一株的Monacolin K产量与出发菌株相比提高4
1倍。采用Nd:Y AG激光对红曲菌出发菌株进行诱变处理，筛选得到一种菌株，其淀粉液化酶活力和产素能力下降，但Monacolin K产量大幅提高，为降脂红曲菌种的优化指明了方向[13]。许赣荣等[14]对不同的红曲菌菌种进行统一的液态培养和固态发酵，并对所得到的液态发酵液和固态发酵红曲米的价和桔霉素含量进行了测定，得到了高价低产桔霉素的红曲菌菌种，经鉴定为紫红曲菌。
1.4 基因工程技术的应用
利用基因工程技术改造红曲菌菌种可望从根本上解决桔霉素生成的问题。通过对红曲素、Monacolin 类化合物和桔霉素的生物合成途径研究，发现这三类物质都是聚酮体化合物，由聚酮体合成酶(PKSs)合成。
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目前，在某些真菌的PKSs研究领域已有很好的基础理论研究，如已发现土曲霉中与Monacolin K合成有关的PKS基因族[15]。由于红曲菌中三类主要的次生代谢产物都是PKSs基因家族的产物，故研究红曲菌PKSs基因的结构和功能，可能是今后筛选高产Monacolin K且不产桔霉素的红曲菌菌种，以及调控红曲菌代谢产物生成的关键。
2 Monacolin K及桔霉素的检测
2.1 Monacolin K的检测
Monacolin K的测定方法主要有紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相谱法(HPLC)、超临界流体谱法等，其中最常用的是以C18柱为分离柱，采用乙腈或甲醇和磷酸水溶液为流动相，并用紫外检测器进行检测的HPLC分析方法。
红曲中的Monacolin K以两种形式同时存在，即闭环的内酯式结构和开环的酸式结构。随着红曲生产加工过程中干燥程度的逐渐增加，酸式结构的Monacolin K逐渐脱水向内酯式结构转化，因此，生产加工工艺不同，产品中两种结构成分的含量也不尽相同。目前，红曲中Monacolin K的HPLC检测方法多采用美国药典中土曲霉内酯式洛伐他丁的检测方法，事实上仅适用于检测红曲中的内酯式Monacolin K。罗仁才等[16]用NaOH将红曲样品碱化处理，使内酯式Monacolin K全部转化为酸式结构，以HPLC法测定了红曲中Monacolin K的总量。
目前，功能性红曲产品的质量参差不齐，目前仍未有国家标准可检测红曲中两种结构的Monacolin K 的含量。许赣荣等[17]将红曲样品的pH值控制在6～7之间，使两种结构的Monacolin K在测定过程中不互相转化，然后分别测定红曲中内酯式和酸式Monacolin K的含量，该方法对于天然功能性红曲的鉴别和质量评价具有重要意义。
2.2 桔霉素的检测
目前红曲中桔霉素的检测方法主要有HPLC-紫外检测法、HPLC-荧光检测法、酶免疫法等。紫外检测的最低检测浓度通常为1mg/ml，而荧光检测的最低检测限可达0.60ng，更适用于功能性红曲中微量桔霉素的检测。酶免疫法测定桔霉素灵敏度亦较高，但所需试剂价格昂贵，未能普及应用。
样品预处理对于减少素在桔霉素测定中的干扰亦很重要。许赣荣等[18]以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7:3:1）为提取溶剂，将红曲样品超声波提取3次后，桔霉素的提取效率最高，同时提取的红曲素最少，为准确检测功能性红曲中的微量桔霉素提供了较好的样品预处理方法。
3 展望
红曲含有天然的HMG-CoA还原酶抑制成分，作为降胆固醇及降血脂的天然药物，药理作用显著且无毒副作用，因而是现代降血脂药物研究中的一个突破性进展。但是，采用传统工艺生产的红曲中的Monacolin类化合物的含量非常低，并有真菌毒素桔霉素的存在，成为功能性红曲发展的瓶颈。因此，强化红曲菌的基础研究和红曲的生产工艺研究应从多方面入手，如通过菌种筛选、菌种诱变和基因重组等技术获得高产Monacolin K而不产桔霉素的理想菌株；深入研究红曲菌代谢产物的生物合成途径，以优化红曲发酵调控技术，从而提高活性成分Monacolin K的含量，抑制桔霉素的产生；利用限制性内切酶酶切片断长度多态性及随机扩增多态性分析技术，出产生Monacolin类化合物等聚酮体的特定DNA片断，通过转基因技术或反义技术来提高活性成分的含量；通过3µm的HPLC高效分离柱的普及和推广
应用，提高红曲中Monacolin类化合物及桔霉素的分析和检测技术，为我国功能性红曲产品的安全使用和国际市场的开拓提供坚实的技术支撑。
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（下转第138页）
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表4 回收率的测定
样品号基准值/mg 加入量/mg 总量/mg 滴定次数HCl/ml 测得值/mg平均测得值/mg 回收率(%)
1 1.010 11.2033
2 1.020 11.3143
1 9.0620 2.5200 11.5820
3 1.005 11.0980
11.205 96.75
1 1.005 11.1479
2 1.002 11.1146
2 9.0150 2.5200 11.5350
3 0.998 11.0702
11.1109 96.32
1 1.000 11.0924
2 1.008 11.1812
3 9.0290 2.5200 11.5490
3 1.005 11.1479
11.1405 96.46
4 结果与讨论
4.1 与常规实验的比较
为了验证微型滴定装置测定结果的可靠性，在实
验中做了微型和常规两种实验装置的平行对比实验。
通过数据处理，可知微型滴定法测定发酵粉中含量与
常规滴定结果基本相符，不存在显著的差异，结果可
靠。见表5。
表5 发酵粉NaHCO3的含量测定数据分析
测定次数微型测定结果(%) 常规测定结果(%)
1 24.39 24.94
2 24.3
3 24.88
3 24.77 24.89
4 24.78 24.34
5 24.34 23.83
平均值24.52 24.58 4.2 误差分析本实验所用微型滴定装置，刻度精细，读数可准
确到0.02ml，估计到0.001ml，每次测定的前后两次读数视差为0.002ml，为了保证这种误差达到常规实验的要求。不大于±0.1%，故被滴定的溶液的体积不小于2.000ml.
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