摘要:目前,分子生物学发展异常迅速,而生物技术育种更掀起了一场作物遗传育种的新革命高潮。生物技术可将植物、动物乃至微生物的基因提取出来,作定向转移,从而更有利于种质资源的拓宽和优势的利用,极大地提高育种的目标性,缩短育种年限,使育种效率得到提高。生物技术中的分子标记技术在大田作物如大豆、水稻、玉米等作物的研究上,已颇具规模,许多遗传连锁图被发现出来。与此同时,转基因技术也取得了长足的进展。生物技术作为一门新兴技术,在大豆育种中应用十分广泛。本文简要介绍分子标记技术在国内外大豆育种应用中的现状,同时概述了转基因技术在大豆育种上的应用情况。 关键词:分子标记;转基因;大豆育种
1分子标记技术的发展及其在大豆育种中的应用
分子标记是以DNA分子的多态性为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反应。随着分子生物学技术的发展，分子标记技术的研究十分活跃，相继有数十种不同的分子标记技术问世，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。
1.1 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP）
RFLP是最早开发的分子标记技术，开创了直接应用DNA多态性的新阶段。它是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反应DNA分子上不酶切位点的分布情况。作为一种有效的分子标记,RFLP最先被应用到大豆遗传研究中(Apuya等1988)。但从建立品种指纹图谱来看,RFLP技术单个探针信息少,鉴别效率不高。在大豆抗病育种中,RFLP有独特的作用。首先,可以对外来病原菌进行筛选。其次,不需要制备病原菌种。再次,克服环境效应,抗病性可以早期选择。Weiscman(1992)Baltazar,Concibido等在研究大豆对孢囊线虫抗性时,证明了RFLP的上述特点。在大豆品质育种方面,RFLP技术改变了过去利用常规育种技术选育高油、高蛋白大豆的方法,将大豆蛋白含量、含油量分别定位于某个特定连锁(Lark,1992),这大大缩短了育种进程。Smeller等(1994),Nelson等(1994)试验证明RFLP技术在评价种质资源变异方面切实有效。
1.2 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD）
此技术建立于PCR反应基础之上，以随机的短脱氧核苷酸（通常为10个碱基）作为PCR引物，对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。惠东威等(1994)对大豆的种间RAPD标
记进行了成功地分析,并根据结果对不同种间的遗传关系作了评价。RAPD技术可以研究育种后代品系与亲本之间的遗传关系,进而从分子水平上明确亲本的遗传特征在经过重组交换与多代选择后在不同子代中的分布。了解优良品种选育的内在因素,继而为优良亲本的选择与利用以及子代的选择提供直接而有价值的参考依据。
1.3 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是RFLP与PCR相结合的产物，其原理是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切后产生的限制性片断，最终多态性以扩增的长短不同和数量多寡显示出来。Keim等(1997),Maughan等(1996)已成功地将AFLP技术应用于大豆遗传图谱构建与遗传多样性研究中,1997年美国USDA/Iowa大学报道,应用于其他植物的最大的AFLP图谱之一,可有效用于大豆基因组研究。
1.4 简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）
所谓SSR（Simple sequence Repeats,简单序列重复）概括地讲,是指由2～6个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段,为共显性标记。作为一种基因组研究的主要分子标记技术,它
具有简便、快速、稳定性高以及等位基因多样性高等特点。SSR标记可作为RFLP标记的重要补充应用于大豆分子生物学,遗传育种等方面,目前的大豆基因图谱中至少有600个SSR标记,吴晓雷等(2001)利用SSR分子标记成功地研究出了大豆属种间亲缘进化关系。
2转基因技术在大豆育种中的应用
自二十世纪80年代以来,利用基因工程技术,各国科学家将外源或经体外修饰后的内源基因导入植物,借以改良植物的性状、品质、抗性等。转基因技术将不同种、属间的优异基因经过体外切割、搭配、重组,删除不良性状,保留有效成份,将此基因导入大豆,从而起到了传统育种无法实现的基因重组的目的,大大地提高了育种水平,开辟了大豆育种新时代。目前,主要应用于育种上的转基因技术方法有:农杆菌介导法、基因法、花粉管通道法、电击法和PEG法等。基因法，其次是花粉管通道法。在大豆转基因抗虫育种方面,国外已获得重要的进展。Parrott等到1992年起用携有Bt结晶蛋白毒性基因和(或)CpTi基因的微弹轰击各种基因型大豆品种的胚状悬浮系,获得转基因植株,后代对黎豆夜蛾幼虫有明显抑制生长的作用。Stewart等(1996)将人工合成的Bt晶体蛋白基因通过基因法导入感虫品种Jack里,获得的转基因植株的后代对棉铃虫、大造桥虫、烟芽夜蛾、黎豆夜蛾等均有较强的抑制作用。
在我国大豆转基因育种中最卓有成效的是品质改良。利用花粉管通道法,我国已获得一批高油、高蛋白、高产的优良大豆品种及株系。雷勃钧(2001年)报道,通过直接导入高蛋白野生大豆DNA,获得东北地区蛋白含量最高的“黑生101”,其蛋白含量达45.44%,已被审定并获国家发明专利。河南周口农科所利用花粉管通道法,将玉米总DNA导入大豆中,获得高油高产大豆“周豆12号”,其脂肪含量达22.56%,已审定推广并报请国家品种保护。
近几年，国内转基因技术发展迅猛，各大高校、院企在转基因育种方法都取得了喜人的成绩。其中大北农集团的耐除草剂大豆（DNB-09004-6）已获得中国进口安全证书，这意味着此产品可在阿根廷进行商业化种植。另外上海交通大学研发的抗草甘膦转基因大豆（SHZD32-01）也已获得国内转基因安全证书。截止日前，已有多个转基因大豆材料完成生产性试验，进入安全证书申请阶段。这标志着转基因技术在大豆育种中已得到广泛应用。
结束语
在大豆育种日新月异的今天,生物技术对大豆品质改良,抗性提高等方面起着举足轻重的作用。我们有理由相信,未来几年,我国农业必将以生物技术为龙头迈向更高的台阶。
参考文献
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