项目名称：
推荐单位：
浙江省农业科学院
项目简介：
1、创建疣粒野生稻原生质体体细胞杂交等技术，创新水稻抗白叶枯病新种质。（1）创新了水稻原生质体体细胞杂交技术、疣粒野生稻组培快繁、快速构建转基因敲除载体和新型融合标签等新方法，为疣粒野生稻种质保存、遗传转化和利用提供了关键技术。（2）利用体细胞杂交技术将疣粒野生稻遗传物质导入到栽培稻，克服了后代不育难点，创制了132份新种质资源，其中4份广谱高抗白叶枯病，为抗病机理研究和抗病育种提供了新材料。（3）利用所创制的抗病种质材料，构建了多种遗传体，精细定位抗病QTLs，育成5个水稻新品种（系），均含有多个抗病位点，较以往利用单一抗病基因育成的品种，对病害具有广谱抗性，提高了抗性利用水平。
2、揭示疣粒野生稻抗白叶枯病机理。发现疣粒野生稻抗病性由多基因控制，揭示了疣粒野生稻及体细胞杂交后代接种病原后叶片导管细胞细胞壁增厚，抗病性与活性氧、激素信号转导及下游抗病转录调控相关的独特抗病机理，为抗病基因定位和抗病育种提供了理论基础。
3、探明我省水稻新的耕作制度和栽培模式下白叶枯病发生流行的原因。收集我省45年来多点水稻白叶枯病监测数据，解析其发生动态及其影响病害流行的相关因子。揭示了新的耕作制度和栽培模式下病害再度上升流行的主要原因是水稻感病品种种植面积扩大，机械化收获后稻草还田促进病源积累，粗放灌溉、台风暴雨致使晚稻淹水受损有利于病原侵染。
4、探明新的耕作制度下产量损失与病害发生关系，创建病害绿防控技术。（1）揭示了新的耕作制度下水稻主要品种产量损失与病害发生的相互关系，提出了病害防治新指标。（2）创建了基于品种、病情和气象因子的简易病害测报方法和发生流行模型，预报准确率均达到92%以上。（3）筛选出噻唑锌、噻菌铜、噻森铜等新农药已被浙江省农业厅等单位确定为该病防治主推药剂。（4）集成创建了病害绿防控技术，近3年在浙江等6省累计推广应用面积862.64万亩，挽回水稻产量损失2.6亿公斤，节省药治成本8741.50万元，增收节支6.86亿元。其中我省推广应用232.95万亩，挽回产量损失1.02亿公斤，获益2.53亿元。
发表论文56篇（SCI论文20篇），授权国家发明专利3件，选育水稻抗病新品种（系）5个，培养研究生
21人，推动了我省植物病理学科发展和水稻病害绿防控技术进步，整体达到国际先进水平，其中疣粒野生稻原生质体体细胞杂交技术及抗病种质创新达到国际领先水平。
主要科技创新：
（一）立项背景：
水稻白叶枯病是世界水稻重要细菌性病害之一，由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas a, Xoo)引起，感病水稻叶片表现枯黄萎蔫，一般减产20%-30%，严重的达50%以上，甚至绝收。种植水稻抗病品种是预防该病发生最经济有效的途径，目前育成的水稻抗病品种主要含有Xa3，Xa4或xa7，长期使用抗性基因单一的水稻品种，抗性会因为病菌小种变异或适应而丧失，出现病害重新流行的风险。疣粒野生稻（Oryza Meyeriana）对白叶枯病近乎免疫，在水稻抗病育种极具利用价值，但由于疣粒野生稻（GG型染体组）与栽培稻（AA型染体组）无法杂交，如何利用疣粒野生稻抗病基因需要技术突破和创新。
当病害发生时，化学农药是防治白叶枯病的一个有效方法，但长期过量使用化学农药不仅提高水稻生产成本，而且还会造成稻米质量安全和生态环境污染。因此，绿防控病害，不仅需要筛选高效低毒的化学农药，而且需要有准确的病害测报技术和防治指标作指导。
近20年来，本研究团队在863、国家和省自然科学基金、省高校重之重学科建设项目、省“三农五方”科技协作计划等项目支持下，针对白叶枯病抗病新基因挖掘利用、在新的耕作制度下病害发生危害及其绿防治技术等方面进行了系统研究。
（二）技术创新内容：
创新点1、创建疣粒野生稻原生质体体细胞杂交等技术，创新水稻抗白叶枯病新种质。
（1）创建疣粒野生稻原生质体体细胞杂交技术。由于疣粒野生稻与栽培稻亲缘关系较远，杂交不亲和，疣粒野生稻抗性资源的利用长期存在技术瓶颈。本项目通过突破疣粒野生稻原生质体分离技术瓶颈、优化疣粒野生稻与栽培稻不对称融合参数、克服融合细胞植株再生技术障碍，创建了疣粒野生稻原生质体体细胞杂交技术体系，同时，建立了疣粒野生稻组培快繁体系（发明专利号：CN200910101897.6），为疣粒野生稻种质保存和利用提供了技术保证。
（2）利用疣粒野生稻创制广谱抗病新种质。利用体细胞杂交技术创制了132份疣粒野生稻体细胞杂交后代新种质，经国内外30余个白叶枯菌株大田接种和分子鉴定，发现其中4份新种质对白叶枯病表现为高抗，含有广谱抗病新基因。这是首次利用体细胞杂交技术，将疣粒野生稻遗传物质转移到栽培稻，并获得可稳定遗传杂交后代的唯一成功案例。
（3）利用抗病新种质选育抗病新品种（系）。构建、分析并利用包括F2体、重组自交系、多代回交体、单染体片段替换系等体（累计鉴定3万余份材料），对抗病新材料的抗病QTL进行了初步定位、精细定位、单QTL分离纯化、单QTL的精细定位，获得了一系列遗传背景清晰的高抗种质资源，并最终将3个主效QTL（qR1、qR3、qR5）分别定位在第1号（分子标记RM226-RM11787之间）、第3号（R03D146-R03D159之间）和第5号（RM1187-RM7081之间）染体上。利用这些新种质和与抗病基因紧密联锁的分子标记，结合常规和分子标记辅助育种，培育了5个抗病优质水稻新品种（系），其中“甬粳50A”粳型不育系”已通过浙江省审定，“浙粳70”已通过浙江省农作物新品种现场考察，“雪珍”、“寒珍”和“寒香”3个优质米品系已向农业部申请新品种保护，并在嘉兴、宁波、杭州、绍兴等地建立了10个抗病优质米订单生产基地。
创新点2、揭示疣粒野生稻及其体细胞杂交后代对白叶枯病的抗性机理。
（1）揭示了疣粒野生稻特有的抗病机理。发现白叶枯病菌侵染疣粒野生稻后，能够诱导叶片木质部导管细胞次生细胞壁增厚，导管纹孔直径减小，从而限制病菌于导管内，避免病菌向周围薄壁细胞扩散。这种独特的抗性现象在栽培稻中未见报道。
发现疣粒野生稻氧化应激活性氧（ROS）能够瞬间激发抗病级联反应，但与栽培稻不同的是，疣粒野生稻ROS还能诱导叶片内Rubisco活化酶（RCA）从类囊体基质向类囊体膜转移，作为一种分子伴侣加强对疣粒野生稻膜系统的保护，减少ROS对植物自身的损害，是疣粒野生稻独特的抗病机制。
通过构建疣粒野生稻全长均一化cDNA文库和基因增强表达文库，筛选相应的遗传转化材料，获得了2个抗病新基因，分别命名为OmBBR1和OmBBR2，其中OmBBR1为bZIP型转录因子，参与了水杨酸（SA）信号转导，也能够与特定的B型细胞分裂素转录调控因子互作，参与细胞分裂素（CTK）信号的转导，是抗病信号转导的重要节点。OmBBR2为WRKY转录因子，超表达转基因材料对白叶枯病抗性较非转基因对照增强。
（2）揭示了疣粒野生稻体细胞杂交后代的抗病机理。为了克服抗病新种质
Y73遗传转化效率低的技术瓶颈，本项目对遗传转化体系作了3个方面的改进：创建了快速构建转基因敲除载体的方法(发明专利号：CN200910153288.5)，简化了载体构建流程，以满足同时开展多个基因干涉载体构建的需要；优化了悬浮培养基和共培养条件，将Y73的遗传转化效率从29.9%提高到66.5%；通过创制一个既能对潮霉素具有抗性，又有荧光可视化特性的新型融合标签(发明专利号：CN201310082668.0)，有效提高了转基因筛选和鉴定的效率。
高通量测序显示Y73中包含了大量疣粒野生稻的基因组片段。在开展基因定位同时，运用基因芯片和蛋白组学分析手段，对Y73进行了差异基因/蛋白分析，发现Y73在系统获得抗性方面与疣粒野生稻相同：1）Y73中与ROS密切相关的POX和CXD基因的表达较感病对照有明显上调；2）在病菌接种后，Y73中有多个与抗病直接相关的WRKY基因表达提升；3）茉莉酸（JA）信号转导途径JA合成关键基因丙二烯
氧化物合成酶（AOS）及其下游多个基因也明显上调。此外，在泛素-蛋白酶体系统、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联信号通路等途径相关的基因在Y73中的表达与感病对照有着明显的差异（图4）。这些发现揭示了抗病新种质的抗性涉及蛋白质降解、植物激素信号转导、基因转录调控等多个层面，与疣粒野生稻一样是一种综合性的抗性。
创新点3、解析我省水稻白叶枯病的发生动态，探明近年病害流行的主要原因。
通过收集分析温州、温岭、桐庐等地1971-2015年水稻白叶枯病监测数据，解析了我省病害发生动态，其中上世纪70-90年代初为病害重发流行期，90年代中后期-2012年为间歇流行期，近年病情又趋抬头上升，流行潜在风险加大。探明在新的耕作制度和栽培模式下，大面积种植水稻感病品种（如甬优系列品种）及抗性退化，机械化收获后稻草还田促进病源积累，粗放灌溉、台风暴雨致使晚稻秧田淹水、孕穗抽穗期叶片受损，是病害近年再度上升流行的主要原因。
创新点4、探明新的耕作制度下白叶枯病与产量损失的关系，创建病害绿防控技术体系。
（1）探明水稻病情与产量损失关系，确定新的病害防治指标通过田间观测，揭示了新的耕作制度下水稻主要品种产量损失与不同生育期病害发生的关系，构
建了水稻初发病期、病情激增期和稳定期危害损失的12个模型；在模拟台风暴雨条件下，通过病原接种
试验，建立了水稻产量损失与分蘖期、圆秆拔节期和孕穗破口期叶面受损程度关系的3个模型，基于上述模型和经济、生态因素，确定了新的病害防治指标（株发病率5%，叶发病率3%）。
（2）创建简易测报技术和病害发生流行预测模型应用序贯抽样技术减少了秧田期、本田期系统监测和病情普查的抽样数量，提出了查始病期定防治适期、查病情指标定防治对象田“两查两定”技术，取消了噬菌体测定等与预测关联度不大，但工作量大、基层难以做到的工作内容，创建了基于品种、病情和气象因子的简易测报方法(中国科学技术出版社, 2004)，比原系统测报方法，工作量减少了70%以上。应用逐步回归分析方法，建立了病害发生流行程度预测模型：LgY=0.2158LgX1+2.0753Lg(X2+1)-0.3145，经温州、台州、杭州、丽水等地预测验证，中期（20天）和长期（30天以上）预测准确率均达到92%以上。
（3）筛选出病害防治新农药针对我国防治水稻白叶枯病主要药剂敌枯双致畸致突变和叶青双长期使用药效明显下降的状况，研究筛选出噻唑锌、噻菌铜、噻森铜等新一代高效安全防治药剂，在水稻伤口期、初病期的效果分别达91.3%、89.6%、90.1和83.1%、78.7%、80.5%，其防效显著高于叶青双等药剂，对人畜和环境安全，已成为我国水稻白叶枯病等细菌性病害防治的主导药剂。
（4）集成创建病害绿防控技术鉴于晚稻后期多种病害混发、白叶枯病隐性危害大的新情况，将上述研究结果集成创建了基于抗病品种、监测预警、秧田施药保护、大田指标防治与多种病害协同治理的绿
防控技术，编制了简便实用的防治操作手册和模式图，将防治关口前移，注重秧田防治，为病害防控争得主动；监测预警和“查定”防治并重，改变了台风暴雨后普遍防治的观点；多种病害协同防治，既降低防治成本，又提高防治效果，易被农民接受掌握。这项技术应用后，既能保证高产稳产，又能减少施药面积三分之一以上，实现节本增效和生态环境保护。
（三）国内外同类技术的主要参数比较
（1）研究方法创新。创建了原生质体体细胞杂交技术、疣粒野生稻组培快繁方法、快速构建转基因敲除载体方法以及新型融合标签方法，为将疣粒野生稻遗传物质成功导入栽培稻、保存疣粒野生稻种质以及提高新种质遗传转化效率提供了关键技术。这些技术发明与改进均为国际首次报道。
（2）抗病新种质创新。有关疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性早已被鉴定(彭绍裘等, 1982)，但是，由于疣粒野生稻与栽培稻杂交不育，从而阻碍了疣粒野生稻抗病基因的利用。朱永生等（2004）曾经利用体细胞杂交技术试图将疣粒野生稻中的抗白叶枯病基因导入栽培水稻品种，但获得的体细胞杂交后代表现为不育。本项目利用所创建的体细胞杂交技术首次成功将疣粒野生稻的遗传物质导入到栽培稻，获得可稳定遗传杂交后代，创新了广谱高抗白叶枯病的新种质，进而获得了与抗病位点紧密联锁的分子标记。这些研究成果为国际上首次报道。
（3）抗病品种创新。至今国内外已鉴定了38个水稻抗白叶枯病基因，其中已被克隆的有9个(Han et al.
2014, Wang et al. 2015)。利用这些基因，国内外育种家已培育出一大批水稻抗病品种，但是绝大部分抗病基因抗谱较窄，抗性易被病原克服。本项目利用所创制的广谱高抗白叶枯病新种质，育成的抗病新品种（系）含有疣粒野生稻多个抗病位点，较以往利用单一抗病基因育成的品种，对病害具有广谱抗性，提高了抗性利用水平。
（4）抗病机理新认识。有关栽培稻对白叶枯病的抗性机理历史上已有许多研
究，但有关疣粒野生稻的抗性仅仅停留在表观分析，由于技术的局限，抗病分子机理研究为空白。本项目首次揭示疣粒野生稻对白叶枯病的抗性由多基因控制，并从超微结构和分子水平揭示了疣粒野生稻独特的抗病机制。这些研究成果具有原创性。
（5）对我省白叶枯病发生动态和流行主要因子的新认识。收集分析45年来我省多点白叶枯病监测数据，解析该病在我省发生动态及其影响病害流行相关因子，提出近年来在新的耕作制度下病害再度上升流行的主要原因。这在国内外未见类似报道。
（6）病害绿防治技术集成创新。进入21世纪后，由于水稻种植格局、模式、品种与生产水平等都发生了深刻的变化，白叶枯病也出现隐性复合危害的新特点。本项目探明新的耕作制度下水稻产量损失与病情的关系，提出新的防治指标；创建的水稻白叶枯病简易测报方法，较原系统测报方法减少测报工作量70%以上；建立的病害中长期预测模型，预测准确率均达到92%以上；筛选的噻唑锌、噻菌铜、噻森
铜等药剂，比原先用于白叶枯病防治的敌枯双和叶青双等药剂具有更好的防效和安全性。集成创建的病害绿防控技术与之前技术相比，不仅降低了防治成本，而且简便实用，易被农民接受掌握。
主要完成人及技术贡献：
陈剑平，男，研究员，浙江省农业科学院。本项目主持人，完成项目的总体设计并组织项目实施和工作总结。在创新点1和2中，对快速构建转基因敲除载体和新型融合标签等方法创新，疣粒野生稻及其体细胞杂交后代抗病机理、抗性基因功能和抗病基因资源挖掘利用等研究作出了主要贡献。本人在创新点研发工作中投入的工作量占本人工作总量的20%。是本项目3个专利，1个新品种共同完成人，37篇论文的通讯作者。
严成其，男，研究员，浙江省农业科学院。创新点1和2的主要实施者之一，对抗病新种质创新、疣粒野生稻新的抗病基因资源挖掘利用、抗病机理研究和抗病育种等作出了主要贡献，在创新点研发工作中投入的工作量占本人工作总量的90%。参与了创新点3和4的研究工作，占本人工作总量的10%。是本项目3个专利，5个新品种（系）主要完成人，是50篇论文的共同作者。
王华弟，男，研究员，浙江省农药检定管理所。是创新点3和4的主要实施者之一，主持并组织该病发生危害调查、监测预报与防治技术的研究与推广应用，取得显著的经济社会效益，在创新点3和4的研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%。主编《水稻白叶枯病监测预报与综合防治》和《粮食作物病
虫害测报与防治》等书著2册，是2篇论文的共同作者。
杨玲，女，教授，浙江师范大学。创新点2的主要实施者之一，对疣粒野生稻体细胞杂交后代的抗病机理等方面的研究作出了重要贡献，在创新点研发工作中投入的工作量占本人工作总量的30%。是本项目9篇论文的共同作者。
杨勇，男，副研究员，浙江省农业科学院。创新点1和2的主要实施者之一，对疣粒野生稻新的抗病基因资源挖掘利用、体细胞杂交后代中抗病QTLs/基因的定位、连锁分子标记的筛选和疣粒野生稻抗病机理研究等方面作出了主要贡献，在创新点研发工作中投入的工作量占本人工作总量的90%。是本项目3个专利，4个新品种（系）的共同完成人，是28篇论文的共同作者。
王栩鸣，男，副研究员，浙江省农业科学院。创新点1和2的主要实施者之一，对疣粒野生稻全长均一化cDNA文库和基因增强表达文库的构建、体细胞
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