先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序panel及测序方法与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，是关于一种先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序panel及测序方法。

背景技术：

2.先天性晶状体不全脱位(congenital ectopia lentis，cel)是指先天性发育异常的晶状体悬韧带部分或者全部松弛或离断，使得晶状体脱离正常解剖位置。作为眼部重要的屈光结构，cel不仅会导致不同程度的屈光不正和弱视，随着疾病的进一步进展，还会造成其他不可逆的眼部损害，如继发性青光眼、视网膜脱离等，最终致盲。近年来，cel发病率逐渐升高，已成为儿童接受晶状体手术的第二大原因，给社会带来了沉重的负担。
3.cel具有明显的遗传倾向，cel可以单独发病，也可以合并或继发于系统性综合征，如marfan综合征、weill-marchesani综合征、高胱氨酸尿症、亚硫酸盐氧化酶缺乏症等，并且是这些疾病的首发症状。然而，cel的早期诊断充满挑战：既往研究发现，仅从眼部和全身临床表现，及家族史，cel患者早期确诊率仅有19.43％；结合基因检测结果和远期随访观察，cel患者确诊率可以有效提升至40.57％。因此，早期识别cel患者的所属的系统性疾病，对于眼外病变的早期筛查、定期随访和预防性意义重大。而快速准确的基因诊断对于疾病的早发现、早诊断、早具有指导性意义，同时可以辅助医生提高诊疗水平以及诊断效率。
4.cel的发病机制复杂，常与基因异常有关，而且目前尚无针对cel的基因检测试剂盒，这使得cel的精准诊断和非常困难。目前，就我们所知，sanger测序对于候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，并且不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变，现主要用于验证。全外显子检测的优势是全面，能够检测出2-3万个基因，相对而言数据量就非常庞大，对于cel的致病基因检测而言浪费了大部分数据，并且覆盖度不高，准确性较低，成本昂贵。而本发明中panel主要是针对先天性晶状体不全脱位的相关基因设计的，检测基因数目少，能达到很深的测序深度及覆盖度，成本相对低，数据分析快。所谓的测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值，可以理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。测序深度＝reads长度
×
比对的reads数目/参考序列长度。所谓的覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例，指的是基因组上至少被检测到1次的区域，占整个基因组的比例。

技术实现要素：

5.针对先天性晶状体脱位致病基因突变检测的现状，本发明旨在提供一种快速、经济又高效的先天性晶状体脱位致病基因检测方法。为此，本发明根据前期采用全眼科或眼前段靶基因测序在cel患者人中的测序结果，经过优选，得到了41个致病基因，并据此设计了专用于cel的靶基因二代测序panel。
6.因此，本发明的第一个方面，提供了一种先天性晶状体不全脱位(cel)的靶基因二
代测序panel，包括以下41个基因：
7.[0008][0009]
本发明的第二个方面，提供了一种用于专用于cel的靶基因二代测序方法，使用上述的靶基因二代测序panel，包括以下步骤：
[0010]
s1：提取样本的全血基因组dna；
[0011]
s2：对提取的基因组dna进行质控，包括：用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，用nanodrop检测dna的纯度，以及用qubit测量dna的浓度，对合格的样本进行建库；
[0012]
s3：取500ng基因组dna进行片段化，将片段化的基因组dna进行末端补平，并在5’端进行磷酸化和3’末端加碱基a；
[0013]
s4：已末端修复的产物两端连接接头，用磁珠对产物进行纯化及片段分选；
[0014]
s5：对纯化后的接头连接产物进行pcr扩增，用磁珠纯化得到基因组文库，用qubit测定dna浓度；
[0015]
s6：取500ng构建好的基因组文库，使用cel专用靶基因二代测序探针对目标区域进行捕获，将捕获的目的片段分离；
[0016]
s7：对捕获的目的基因pcr扩增，扩增产物用磁珠纯化回收；
[0017]
s8：文库使用qubit定量，毛细管电泳查看文库片段大小，如片段在350-600bp则合格；
[0018]
s9：用illumina测序仪对文库进行测序；
[0019]
s10：对测序结果进行数据分析以获得变异位点信息。
[0020]
根据本发明，s2中所述的选择合格样本的条件如下；
[0021]
琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性的要求：条带单一无弥散；
[0022]
nanodrop检测样本纯度的要求：dna的od260/280值在1.8-2.0；
[0023]
qubit检测样本浓度的要求：＞500ng。
[0024]
根据本发明，s9中所述的测序是使用illumina novaseq 6000测序仪进行双端150bp测序。
[0025]
根据本发明，s10中所述的数据分析包括对于illumina novaseq产生的原始数据进行质控以获得高质量的dna序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点。
[0026]
本发明具有以下有益效果：
[0027]
1、本发明设计了新的专用于cel的靶基因二代测序panel。
[0028]
2、本发明设计的panel具有针对性强、准确性高等特点。
[0029]
3、挑选出41个靶基因，组合成了panel，降低了测序成本，提高了测序深度。
附图说明
[0030]
图1显示了本发明的panel与全外显子相比的目标区域平均覆盖深度的结果，图中number of average reads是指平均读段数，panel特指本技术针对特定位置设计的panel基因测序包在目标区域的平均覆盖深度，wes是指全外显子组测序在目标区域的平均覆盖深度。
[0031]
图2a显示了晶状体脱位panel检测到案例的突变类型，图2b显示了检测到的突变位点在基因体的分布情况，图中exonic表示在外显子上检测到的snv(点突变)位点；exonic；splicing表示在外显子剪切位点上的snv位点。
具体实施方式
[0032]
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
[0033]
实施例1
[0034]
本实施例是采用illumina二代测序技术对受检人血浆中的基因组dna进行检测，具体操作步骤如下：
[0035]
s1：提取样本的血液基因组dna：使用康为世纪的cwe2100 blood dna kit v4试剂盒搭配康为世纪全自动核酸提取仪(cwe2100)提取受检人的血液基因组dna，步骤按照说明书操作。
[0036]
s2：对基因组dna进行质控，包括采用琼脂糖凝胶电泳检测样本的完整度、用nanodrop检测样本的纯度、以及采用qubit检测样本的浓度，选择合格的样本用于建库；
[0037]
其中：
[0038]
琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性的要求：条带单一无弥散；
[0039]
nanodrop检测样本纯度的要求：dna的od260/280值在1.8-2.0；
[0040]
qubit检测样本浓度的要求：＞500ng。
[0041]
使用诺维赞universal plus dna library prep kit for illumina v2试剂盒进行全基因组建库，接头试剂盒dual umi udi adapters set 1-set 4 for illumina。
[0042]
s3：取500ng dna进行片段化，将片段化的基因组dna进行末端补平，并在5
′
端进行磷酸化和3
′
端加da尾，反应体系如下：
[0043]
成分体积(μl)dna样本35fea buffer v25fea enzyme mix v210总体积50
[0044]
反应物涡旋混匀，离心后pcr仪上进行以下反应：
[0045]
反应温度反应时间37℃6min65℃30min4℃∞
[0046]
s4：在已片段化并末端修复加a的产物两端加接头序列，反应体系如下：
[0047]
成分体积(μl)片段化末端修复加a的产物50rapid ligation buffer v225rapid dna ligase v25nuclease-free water15dna adapter-s for illumina5总体积100
[0048]
反应物涡旋混匀，于20℃反应15min，然后4℃保存。
[0049]
使用vahts dna clean磁珠纯化样本，磁珠与样本的体积比0.6:1，用105μlnuclease-free water洗脱，最后得100μl洗脱液，具体操作如下：
[0050]
1)将vahts dna clean磁珠平衡至室温，涡旋混匀；
[0051]
2)取60μl vahts dna clean磁珠加入连接产物中，涡旋混匀，室温放置5min后静置于磁力架上2min；
[0052]
3)磁珠完全分离后去上清，保持样品置于磁力架上，加200μl新鲜配制80％乙醇，30sec后去上清，然后再重复用80％乙醇洗涤一次；
[0053]
4)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖于空气中干燥磁珠3～5min，勿过分干燥；
[0054]
5)加105μl nuclease-free water，使用移液器吹打混匀，室温放置2min后静置于磁力架上5min，磁珠完全分离后转移100μl上清到一支新的0.2ml pcr管。
[0055]
对纯化后的产物用vahts dna clean磁珠进行片段分选，具体操作步骤如下：
[0056]
1)吸取53μl vahts dna clean磁珠至上述100μl产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min后静置于磁力架上5min，小心转移上清至新pcr管中，丢弃磁珠；
[0057]
2)吸取12μl vahts dna clean磁珠至上清液中，用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min后静置于磁力架上5min，小心弃上清；
[0058]
3)保持样品置于磁力架上，加200μl新鲜配制80％乙醇，30sec后去上清，然后再重复洗涤一次；
[0059]
4)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖于空气中干燥磁珠3～5min，勿过分干燥；
[0060]
5)加22.5μl nuclease-free water，使用移液器吹打混匀，室温放置2min后静置于磁力架上5min，磁珠完全分离后转移20μl上清到一支新的0.2ml pcr管，切勿触碰磁珠。s5：对片段分选后的连接产物进行pcr扩增，反应体系如下：
[0061]
成分体积(μl)片段分选过的接头连接产物20vahts hifi amplification mix25
pcr primer mix 3 for illumina5总体积50
[0062]
反应物混匀离心后，放在pcr仪上，程序如下：
[0063][0064]
用0.9
×
vahts dna clean磁珠对pcr产物进行纯化得到基因组文库，具体如下：
[0065]
1)将vahts dna clean磁珠平衡至室温，涡旋混匀；
[0066]
2)取45μl vahts dna clean磁珠加入连接产物中，涡旋混匀，室温放置5min后静置于磁力架上2min；
[0067]
3)磁珠完全分离后去上清，保持样品置于磁力架上，加200μl新鲜配制的80％乙醇，30sec后去上清，然后再重复用80％乙醇洗涤一次；
[0068]
4)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖于空气中干燥磁珠3～5min，勿过分干燥；
[0069]
5)加22.5μl nuclease-free water，使用移液器吹打混匀，室温放置2min后静置于磁力架上5min，磁珠完全分离后转移20μl上清到一支新的1.5ml pcr管，得到基因组dna文库。
[0070]
用qubit荧光定量仪测定dna浓度。
[0071]
s6：dna文库杂交捕获
[0072]
在1.5ml离心管中混合以下组分，使用真空干燥的方法浓缩，到刚好抽干：
[0073]
组分体积s5得到的基因组dna文库500ngcot-1 dna5μlxgen universal blockers-ts mix2μl
[0074]
室温下自然溶解所有xgen杂交和清洗试剂。
[0075]
将以下试剂加入到真空浓缩干燥的离心管中，避光静止10min重溶，期间5min涡旋离心1次：
[0076]
反应温度(热盖100℃)反应时间95℃30s65℃∞
[0077]
移液器吹打混匀，并转移到low-bind 0.2ml pcr管中，并立即加入cel panel探针4μl，运行以下程序：
[0078]
反应温度(热盖100℃)反应时间95℃30s
65℃∞
[0079]
这里所使用的cel专用靶基因二代测序探针是根据上述靶基因二代测序panel的41个基因的序列而设计，用于捕获相应的基因，委托integrated dna technologies公司设计合成。
[0080]
按照以下表格准备清洗液：
[0081][0082]
对准备的wash buffer i和stringent wash buffer进行分装，并按照下表规定的温度储存，其余1
×
buffers保持在室温：
[0083][0084]
将m-270streptavidin beads室温静置约30分钟，漩涡混匀15s。吸取50μl m270磁珠至1.5ml低吸附离心管中，放置在磁力架上，磁珠与上清液分离后，吸取并丢弃上清液。
[0085]
向离心管中加入100μl 1
×
bead wash buffer，轻柔吹吸混匀10次，瞬时离心，置于磁力架上数分钟，待液体完全澄清，使用移液器移弃上清。将离心管从磁力架上移出。
[0086]
用1
×
bead wash buffer再重复清洗步骤两次。
[0087]
向含有m270 beads的离心管中加入17μl磁珠悬浮液(如下表)：
[0088]
组分体积nuclease-free water5.8μlxgen 2
×
hybridization buffer8.5μlxgen hybridization buffer enhancer2.7μltotal master mix volume17.0μl
[0089]
轻柔吹吸10次混匀，将全部磁珠悬浮液转移至1个新的0.2ml低吸附pcr管中。放回pcr仪(pcr仪的热盖温度设置为75℃)上65℃继续孵育45min，期间每12min涡旋振荡一次，确保磁珠完全重悬。
[0090]
孵育结束后从pcr仪上取下pcr管，并向其中加入100μl 65℃的1
×
wash buffer i，吹吸混匀含有磁珠的杂交体系，将pcr管置于磁力架上1min，待液体完全澄清后，使用移液器吸取移弃上清。
[0091]
将pcr管从磁力架上移出，加入150μl 65℃的1
×
stringent wash buffer，轻柔吹
吸10次混合均匀，放进pcr仪中65℃孵育5min，pcr管放在磁力架上，使磁珠与上清完全分开。立即吸取并丢弃含有未结合dna的上清液。重复此步骤一次。
[0092]
加入150μl室温1
×
wash buffer i并涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30sec后静置30sec，交替进行，确保充分混匀；将pcr管放在磁力架上1min，待液体完全澄清后吸取移弃上清。
[0093]
加入150μl室温1
×
wash buffer ii并涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30sec后静置30sec，交替进行，确保充分混匀；将pcr管放在磁力架上1min，待液体完全澄清后吸取移弃上清。
[0094]
加入150μl室温1
×
wash buffer iii并涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30sec后静置30sec，交替进行，确保充分混匀；将pcr管放在磁力架上1min，待液体完全澄清后吸取移弃上清。
[0095]
从磁力架上取出含有捕获dna的含有磁珠的管子，向磁珠中加入20μl nuclease-free water，吹打混匀10次，确保任何挂在管壁的磁珠已经重悬。
[0096]
s7：按以下反应体系进行产物扩增：
[0097][0098]
短暂漩涡震荡并瞬时离心pcr mix，确保磁珠保留在溶液中。放置在pcr管中，运行以下程序，热盖设置105℃：
[0099][0100]
磁珠纯化pcr产物，具体如下：
[0101]
1)从4℃冰箱取出磁珠，将magicpure size selection dna beads置于室温下至少30min。将试剂漩涡震荡混合至颜均匀一致。
[0102]
2)向1.5ml离心管中加入75μl的均匀的磁珠(1.5x)，并加入amplified library(50μl)。在漩涡混匀器上混匀并室温放置10min。
[0103]
3)将离心管放在磁力架上5min直至溶液澄清，弃掉上清，不要碰到beads。
[0104]
4)继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入125μl 80％的乙醇，放置30s，弃掉乙醇。重复乙醇清洗步骤1次。
[0105]
5)保持1.5ml离心管在磁力架上，室温晾干磁珠。
[0106]
6)加入22μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温孵育5min，把离心管放在磁力架上，静置2-3min，直到溶液澄清。
[0107]
7)将20μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。
[0108]
s8：用qubit测定文库浓度，用毛细管电泳方法查看文库片段大小，片段大小需要在350-600bp之间。
[0109]
s9：文库合格后上机测序，使用illumina novaseq 6000测序仪进行双端150bp测序。
[0110]
s10：数据分析
[0111]
illumina novaseq 6000产出的测序结果是fastq形式的dna序列，对于illumina novaseq产生的原始数据进行质控以获得高质量dna序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点。
[0112]
利用clinvar hgmd、genom ad、1000genome等多个数据库对产生的高质量变异位点进行注释，将注释过的变异位点信息更新到asld(amplicongene subluxation of lens database，上海昂朴生物科技有限公司)中，并使用asld对变异位点进行进一步注释，配合临床表现对可疑位点进行筛选，对于未到可疑位点的样本进行cnv(拷贝数据变异)筛选，即可整理出诊断报告。
[0113]
实施例2
[0114]
取39个先证者病例样本，采用实施例1的方法进行检测。所有先证者病例均来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，具体如下：
[0115]
[0116][0117]
以上述方法检测了39个先证者样本，将检测结果与实际临床诊断结果相比较，最终的检出率达到87.18％。
[0118]
实施例3
[0119]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，男性，6周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为双眼晶状体不完全脱位。
[0120]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者存在与疾病表型相关性完全符合的变异，具体变异信息如下表所示：
[0121][0122]
asph基因为traboulsi综合征相关，该综合征可能存在晶状体脱位临床表征。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.1126c
→
t(胞嘧啶
→
胸腺嘧啶)引起氨基酸变化：p.r376x(精氨酸
→
终止密码子)，此点为无义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。asph基因报道为常染体隐性遗传(ar)。理论上必须在两个等位基因上均发生突变才有可能致病(纯合或复合杂合)。该样本在此基因上发现了1个纯合变异位点，理论上可能致病。
[0123]
结果显示：先证者临床学表征和检测到asph基因突变可能引发的疾病表征一致，故可认为利用上述方法，可以测检出先证者所携带的致病相关基因潜在突变位点。
[0124]
通过在数据分析过程中产生的质控文件统计得到图1，比较先证者的panel结果跟全外显子目标区域平均覆盖深度，发现panel的目标区域平均覆盖深度是全外显子的5倍多。
[0125]
通过分析先证者的突变类型比例以及突变位点在基因体分布比例得到图2，其中图2a显示了晶状体脱位panel检测到案例的突变类型，图2b显示了检测到的突变位点在基因体的分布情况，可知利用本发明中设计的panel能够检测到大多数突变类型，除了能够检测到全外显子上的突变，同时也测到了剪接位点的突变。
[0126]
通过对先证者捕获的突变位点进行统计，可知利用本发明中设计的panel，能够检测出先证者在splicing位点的突变信息。
[0127]
实施例4
[0128]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，男，38周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为双眼半晶脱。
[0129]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0130][0131][0132]
adamtsl4基因为晶状体及瞳孔异位，常染体隐性单纯性晶状体异位相关。该样本在此基因上发现了2个变异位点：c.2177+4a
→
g(腺嘌呤
→
鸟嘌呤)引起氨基酸变化：-，此点为剪接突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。c.2263缺失g引起氨基酸变化：p.g757vfs*61，此点为移码突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0133]
adamtsl4基因报道为常染体隐性遗传(ar)，理论上只有两个等位基因均发生突变(纯合或者复合杂合)才有可能致病。该样本在此基因上发现了2个变异位点，经验证，两个变异位点分别来自父母，符合遗传规律，理论上可能致病。
[0134]
实施例5
[0135]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，女，6周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为右眼晶状体不全脱位。
[0136]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0137][0138]
fbn1基因为acromicric发育不良(acmicd)；常染体显性单纯性晶状体异位1型(ectol1)；geleophysic发育不良2型(gphysd2)；marfan脂肪营养不良综合征(mfls)；马凡氏综合征(mfs)；mass综合征；僵硬性皮肤综合征(ssk)；weill-marchesani综合征2型(wms2)相关。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.4589g
→
c(鸟嘌呤
→
胞嘧啶)引起氨基酸变化：p.r1530p(精氨酸
→
脯氨酸)，此点为错义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0139]
fbn1基因报道为常染体显性遗传(ad)。理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病，该样本在此基因上发现了1个变异位点，经验证，该位点来自母亲(母亲患病)，符合遗传规律，理论上可能致病。
[0140]
实施例6
[0141]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，女，7周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为双眼晶体不完全脱位。
[0142]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证
[0143][0144]
者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0145]
fbn1基因为acromicric发育不良(acmicd)；常染体显性单纯性晶状体异位1型(ectol1)；geleophysic发育不良2型(gphysd2)；marfan脂肪营养不良综合征(mfls)；马凡氏综合征(mfs)；mass综合征；僵硬性皮肤综合征(ssk)；weill-marchesani综合征2型(wms2)相关。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.4582+3插入t引起氨基酸变化：-，此点为剪接突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0146]
fbn1基因报道为常染体显性遗传(ad)。理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病，该样本在此基因上发现了1个变异位点,理论上可能致病。
[0147]
实施例7
[0148]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，女，65周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为马切山尼综合症，双眼晶状体不全脱位。
[0149]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0150][0151]
adamts17基因为weill-marchesani样综合征相关。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.2292g
→
c(鸟嘌呤
→
胞嘧啶)引起氨基酸变化：p.l764f(亮氨酸
→
苯丙氨酸)，此点为错义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0152]
adamts17基因报道为常染体隐性遗传(ar)。理论上必须在两个等位基因上均发生突变才有可能致病(纯合或复合杂合)。该样本在此基因上发现了1个纯合变异位点，理论上可能致病。
[0153]
实施例8
[0154]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，男，4周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为双眼晶状体半脱位。
[0155]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0156][0157]
adamtsl4基因为晶状体及瞳孔异位；常染体隐性单纯性晶状体异位(ectol2)相关。该样本在此基因上发现了2个变异位点：c.1749+1g
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a(鸟嘌呤
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腺嘌呤)引起氨基酸变化：-，此点为剪接突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。c.2236c
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t(胞嘧啶
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胸腺嘧啶)引起氨基酸变化：p.r746c(精氨酸
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半胱氨酸)，此点为错义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0158]
adamtsl4基因报道为常染体隐性遗传(ar)。理论上必须在两个等位基因上均发生突变才有可能致病(纯合或复合杂合)。该样本在此基因上发现了2个变异位点，经验证，其中一个位点来自父亲，另一个位点来自母亲，父母表型正常，符合遗传规律。理论上可能致病。
[0159]
实施例9
[0160]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，男，5周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为双眼晶状体不全脱位，疑似马凡综合症。
[0161]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0162][0163]
fbn1基因为acromicric发育不良(acmicd)；常染体显性单纯性晶状体异位1型(ectol1)；geleophysic发育不良2型(gphysd2)；marfan脂肪营养不良综合征(mfls)；马凡氏综合征(mfs)；mass综合征；僵硬性皮肤综合征(ssk)；weill-marchesani综合征2型
(wms2)相关。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.2087g
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t(鸟嘌呤
→
胸腺嘧啶)引起氨基酸变化：p.c696f(半胱氨酸
→
苯丙氨酸)，此点为错义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。
[0164]
fbn1基因报道为常染体显性遗传(ad)。理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病，该样本在此基因上发现了1个变异位点，经验证，父亲和奶奶(表型正常)杂合携带，有文章报道fbn1基因引起的疾病不完全外显表达(pmid:15598221)，理论上可能致病。
[0165]
实施例10
[0166]
本实施例的先证者病例来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，男，5周岁。该患者因视力问题入院，临床初判为晶状体不全脱位、球形晶状体。
[0167]
抽取先证者血液样本，采用实施例1的方法，经由上述捕获测序结果分析，发现先证者在产品检测范围内存在与疾病表型相关的可能致病性变异。
[0168][0169]
asph基因为面部畸形-晶状体脱位-眼前节异常合并自发性结膜囊滤泡(fdlab)相关。该样本在此基因上发现了1个变异位点：c.2075g
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a(鸟嘌呤
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腺嘌呤)引起氨基酸变化：p.g692d(甘氨酸
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天冬氨酸)，此点为错义突变，hgmd数据库(人类基因突变数据库)未有此位点报道。asph基因报道为常染体隐性遗传(ar)。理论上必须在两个等位基因上均发生突变才有可能致病(纯合或复合杂合)。该样本在此基因上发现了1个纯合变异位点，经验证，该位点分别来自父母，符合遗传规律，理论上可能致病。

技术特征：

1.一种先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序panel，其特征在于包括以下41个基因：
2.一种先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序方法，使用权利要求1所述的靶基因二代测序panel，其特征在于包括以下步骤：s1：提取样本的全血基因组dna；s2：对提取的基因组dna进行质控，包括：用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，用nanodrop检测dna的纯度，以及用qubit测量dna的浓度，对合格的样本进行建库；s3：取500ng基因组dna进行片段化，将片段化的基因组dna进行末端补平，并在5’端进行磷酸化和3’末端加碱基a；s4：已片段化并末端修复的产物两端连接接头，用磁珠对产物进行纯化及片段分选；s5：对纯化后的接头连接产物进行pcr扩增，用磁珠纯化得到基因组文库，用qubit测定dna浓度；s6：取500ng构建好的基因组文库，使用先天性晶状体不全脱位专用靶基因二代测序探针对目标区域进行捕获，将捕获的目的片段分离；s7：对捕获的目的基因pcr扩增，扩增产物用磁珠纯化回收。s8：文库使用qubit定量，毛细管电泳查看文库片段大小，如片段在350-600bp则合格；s9：用illumina测序仪对文库进行测序；s10：对测序结果进行数据分析以获得变异位点信息。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，s2中所述的选择合格样本的条件如下：琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性的要求：条带单一无弥散；nanodrop检测样本纯度的要求：dna的od260/280值在1.8-2.0；qubit检测样本浓度的要求：＞500ng。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，s9中所述的测序是使用illumina novaseq 6000测序仪进行双端150bp测序。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，s10中所述的数据分析包括对于illumina novaseq产生的原始数据进行质控以获得高质量的dna序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点。

技术总结

本发明公开了一种先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序panel，包括41个基因。本发明还公开了使用所述的靶基因二代测序panel进行的先天性晶状体不全脱位的靶基因二代测序方法。本发明设计了新的专用于先天性晶状体不全脱位CEL的靶基因二代测序panel，设计的panel具有针对性强、准确性高等特点，并且，通过挑选出41个靶基因组合成了panel，降低了测序成本，提高了测序深度。提高了测序深度。提高了测序深度。