(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811392904.8
(22)申请日 2018.11.21
(71)申请人 温州医科大学附属第一医院
地址 325000 浙江省温州市府学巷2号温州
医科大学附属第一医院
(72)发明人 陈必成 凌发忠
(74)专利代理机构 北京康思博达知识产权代理
事务所(普通合伙) 11426
代理人 范国锋 路永斌
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
测方法
(57)摘要
本发明公开了一种用于慢病毒RCL检测的引
物对、探针、试剂盒及其检测方法，所述引物对的
序列分别包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所 示的核苷酸序列，所述探针序列为如SEQ ID
NO.3所示的核苷酸序列。本发明所提供的引物对
和探针序列，特异性强，灵敏度和重复性高，所述
检测方法检测周期短，检测精度高，可检测出的
样本浓度下限低。
权利要求书1页 说明书13页序列表1页 附图2页CN 109295261 A 2019.02.01
C N 109295261
A
1.一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测慢病毒RCL的探针，其特征在于，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：
步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段；
步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒；
步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤i包括以下子步骤：
步骤i -a，获取慢病毒RCL的cDNA；
步骤i -b，以上述获取的cDNA为模板，扩增得到慢病毒RCL的靶序列片段。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤ii包括以下子步骤：
步骤ii -a，将得到的靶序列片段与载体进行连接； 步骤ii -b，将连接好的载体转化至感受态细胞中进行表达，然后加入液体培养基进行培养，得到菌液；
步骤ii -c，将上述菌液涂布至平板培养基上培养，待形成单菌落后，挑选单菌落进行检测；
步骤ii -d，根据检测结果，选取菌落进行扩大培养，然后抽提质粒。
9.一种检测慢病毒RCL的方法，优选采用权利要求3至8之一所述的试剂盒进行，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，对待测样本进行处理；
步骤2，对处理后的待测样本进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述检测优选采用荧光定量PCR 方法进行，所述反应程序为：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。
权 利 要 求 书1/1页CN 109295261 A
一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法。
背景技术
[0002]慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因载体，其是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。但是，操作慢病毒载体仍有一些隐患，主要在于：(a)可能产生自我复制的有感染能力的慢病毒(RCL)；(b)肿瘤生成的潜在可能性；(c)转基因的潜在毒性。
[0003]为了改善慢病毒的生物安全，人们做出了很大的努力。其中，针对主要可获得的商品化慢病毒系统——第二和第三代慢病毒系统，采取了很多安全措施以降低风险。主要包括：通过去除辅助基因减少或消除HIV-1致病性；通过包装蛋白和酶用不同的载体表达来减少包装构建体之间的同源性，以降低同源重组的可能性。此外，由于剔除了3'LTR，慢病毒自身是无活性的，以上措施的施用减少了病毒同源重组和动员整合载体的可能性。[0004]随着慢病毒在基因和细胞中的应用，慢病毒载体在医学中显示出了希望。然而，由于插入突变有产生有复制能力病毒的潜在风险，慢病毒载体的安全性和遗传毒性已成为阻碍其用于的主要原因。Paul Escarpe等人使用VSV Gag基因表型假型病毒作为慢病毒RCL的标准来进行检测，该方法通过将载体样品在细胞系C8166-45暴露于7天以增加RCL感染和扩增的机会，然后将培养物定期稀释六次以允许RCL扩增，每次收集培养上清液样品，通过测量p24衣壳蛋白浓度来分析病毒的复制情况。此方法操作繁琐复杂，检测周期过长，且不能快速检测出慢病毒RCL。
[0005]因此，提供一种操作简单、检测周期短且灵敏度高的慢病毒RCL检测方法是目前亟需解决的问题。
发明内容
[0006]为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，针对VSV Gag基因设计了用于检测慢病毒RCL的一对特异性引物和探针，并结合标准阳性质粒，通过荧光定量PCR方法能对慢病毒进行快速、准确的检测，从而完成了本发明。
[0007]具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
[0008]第一方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其中，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0009]第二方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的探针，其中，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0010]第三方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一
方面所述的引物对和第二方面所述的探针。
[0011]其中，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。
[0012]其中，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：
[0013]步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段；
[0014]步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒；
[0015]步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。[0016]其中，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。
[0017]其中，步骤i包括以下子步骤：
[0018]步骤i-a，获取慢病毒RCL的cDNA；
[0019]步骤i-b，以上述获取的cDNA为模板，扩增得到慢病毒RCL的靶序列片段。[0020]其中，步骤ii包括以下子步骤：
[0021]步骤ii-a，将得到的靶序列片段与载体进行连接；
[0022]步骤ii-b，将连接好的载体转化至感受态细胞中进行表达，然后加入液体培养基进行培养，得到菌液；
[0023]步骤ii-c，将上述菌液涂布至平板培养基上培养，待形成单菌落后，挑选单菌落进行检测；
[0024]步骤ii-d，根据检测结果，选取菌落进行扩大培养，然后抽提质粒。
[0025]第四方面，提供了一种检测慢病毒RCL的方法，优选采用所述的试剂盒进行，其其中，所述方法包括以下步骤：
[0026]步骤1，对待测样本进行处理；
[0027]步骤2，对处理后的待测样本进行检测。
[0028]其中，步骤2中，所述检测优选采用荧光定量PCR方法进行，所述反应程序为：95℃下预变性30s；然后95℃变性5s，60℃退火和延伸共30s，进行40个循环，4℃保存。[0029]本发明所具有的有益效果包括：
[0030](1)本发明所提供的引物对和探针序列，特异性强，灵敏度和重复性高；[0031](2)本发明所提供的试剂盒，使用方便，操作简单，成本低；
[0032](3)本发明所提供的检测方法，对检测仪器的要求低，检测周期短，检测精度高，可检测出的样本浓度下限低。
附图说明
[0033]图1示出了本发明实施例1中重组载体的蓝白斑菌落生长情况；
[0034]图2示出了本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0035]图3示出了本发明实施例2中六个梯度浓度的重组质粒的荧光定量PCR扩增结果图。
具体实施方式
[0036]下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
[0037]第一方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0038]优选地，所述正向引物序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0039]在本发明中，优选将GeneBank中所有的Gag基因的序列进行比对，得到相对保守的靶序列片段，所述靶序列包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0040]其中，Gag基因编码HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)的核心蛋白。
[0041]在本发明中，针对上述保守的靶标序列，应用Primer Express 3.0软件对其进行生物信息学分析，设计得到所述的引物序列。
[0042]其中，在引物设计的过程中应避免出现发夹结构和引物二聚体等情况。[0043]第二方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的探针，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0044]在本发明中，针对所述相对保守的靶序列，应用Primer Express 3.0软件对其进行生物信息学分析，设计得到所述探针序列。
[0045]优选地，所述探针序列的5'端带荧光基团FAM，3'端带有淬灭基团TAMRA。[0046]第三方面，本发明提供了一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的引物对，以及如SEQ ID NO.3所示的探针。
[0047]根据本发明一种优选的实施方式，所述如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成的引物对的浓度为10μM，所述如SEQ ID NO.3所示的探针的浓度为10μM。[0048]根据本发明一种优选的实施方式，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。
[0049]其中，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启
动DNA聚合酶。
[0050]其中，所述dNTPs指的是脱氧核糖核苷酸，包括dATP，dTTP，dCTP和dGTP，在生物DNA 合成中以及各种PCR反应中起原料作用。
[0051]根据本发明一种优选的实施方式，所述标准阳性质粒是指用于检测慢病毒RCL的阳性对照，以检验反应体系和反应条件能否正常进行。
[0052]根据本发明一种优选的实施方式，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：[0053]步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段。
[0054]其中，所述步骤i包括以下子步骤：
[0055]步骤i-a，获取慢病毒RCL的cDNA。
[0056]在本发明中，先提取慢病毒RCL的RNA，然后将RNA反转录为cDNA。
[0057]其中，所述待测样本的RNA采用病毒基因组RNA提取试剂盒进行抽提提取，如TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。
[0058]根据本发明一种优选的实施方式，将RNA反转录为cDNA所采用的反应体系包括如下配比的组分：
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