(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810257388.1(22)申请日 2018.03.27
(71)申请人 和元生物技术（上海）股份有限公司
地址 201321 上海市浦东新区国际医学园
区紫萍路908弄19号楼(72)发明人 杨蕊菊 孙子豪 杨兴林 潘讴东 (51)Int.Cl.
C12N 15/867(2006.01)C12N 15/66(2006.01)
(54)发明名称
一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用(57)摘要 本发明涉及一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用。所述慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR 扩增得到tCBh片段替换pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro载体中PGK得到。tCBh启动子驱动表达mCherry基因和Puromycin 抗性基因，可以使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞；mCherry基因有助于判断病毒包装效率以及感染效率，同时也有助于稳定细胞的筛选。通过转染荧光观察，证明该慢病毒双启动子载体表达系统构建成功，为进一步研究感 兴趣的目的基因提供基础载体。
权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图4页
CN 108441516 A 2018.08.24
C N 108441516
A
1.一种慢病毒CMV -CBh双启动子改造载体构建及应用，所述慢病毒载体pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -tCBh -mCherry -T2A -Puro由PCR扩增得到tCBh片段(序列如SEQ ID No. 3所示)替换pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -PGK -mCherry -T2A -Puro(序列如SEQ ID No. 4所示)载体中PGK得到。
2.构建如权利要求1 所述的慢病毒载体pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -tCBh -mCherry -T2A -Puro，其特征在于，所述载体的碱基序列如SEQ ID No.5 所示。
3.构建如权利要求1 所述的慢病毒载体pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -tCBh -mCherry -T2A -Puro，其特征在于，所述载体结构如图1所示。
4.构建如权利要求1 所述的慢病毒CMV -CBh双启动子改造载体的方法，所述方法包括：(1) 片段tCBh的扩增：以Addgene采购的 Multiplex CRISPR/Cas9 Assembly System Kitprotocol 中的pX330A -1x2 质粒. (所述载体结构如图2所示)为模板，设计特异性引物扩增获得；所述扩增片段 tCBh的引物序列如下：
tCBh -F: 5'- ACGAGCTGTACAAGTCTAGATAATCGAGGTGAGCCCCACGT -3'tCBh -R: 5'-TGCTCAC
CATGGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCCAACCTGAAAAAAAGTGATTTC -3'(2)慢病毒载体pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -tCBh -mCherry -T2A -Puro的构建：用XbaI 和BspMI酶切载体pLenti -CMV -3FLAG -EGFP -PGK -mCherry -T2A -Puro(所述载体结构如图3所示)，回收大片段后和tCBh片段进行无缝克隆。
5.如权利要求1 所述的CMV -CBh双启动子慢病毒表达载体在慢病毒载体构建中的应用。
权 利 要 求 书
1/1页
CN 108441516 A
一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用。
背景技术
[0002]双向启动子：位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。[0003]双向启动子在真
核生物基因组中广泛分布，大多数的双向启动子缺少TATA盒，而具有较高的GC含量和丰富的CpG岛.双向启动子双向起始转录，且会对其双向转录的基因在共表达和稳定性表达调控中发挥一定的作用。
[0004]在对生物进行转基因改良的过程中，可能需要将不止一个的外源基因转入到特定的生物体内，这些外源基因需要在各自相应的启动子序列的调控下进行表达.由于用于遗传改良的启动子数量有限，所以在将多个基因转入生物体内时经常重复地使用一个特定的启动子或序列相近的启动子.这样虽然可以实现同时转入多个基因的愿望，但这种载体的构建费时费力.另一方面，因为引入的启动子序列同源，即使两个启动子之间只有90bp的序列同源，导入生物体内就会引起基因表达“共抑制”现象，导致基因转录的沉默，这是在转基因技术中所要面临的困难和挑战.
[0005]由于双向启动子能够在两个方向上指导mRNA的生成，这样在利用双向启动子进行转基因时，可以在其两端融合某生理或生化过程的两个基因或多个基因及其组合.这不仅避免了不同基因引入时的繁琐步骤，减少了引入受体生物中的启动子数目，更不必担心引入生物体内的启动子之间序列同源而导致的转基因沉默现例子并不多，并且子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程研究和应用领域具有不可估量的作用，正成为转基因技术研究的新领域。
发明内容
[0006]下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0007] 1.本发明的内容是构建共用增强子反向双启动子慢病毒表达载体
[0008] 2.本发明采用的技术方案是：
[0009]一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用。所述慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR扩增得到tCBh片段替换pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro载体中PGK得到。
[0010] 3.本发明还涉及构建所述的慢病毒载体的方法，所述方法包括：
[0011](1)片段tCBh的扩增：以质粒pX330A-1x2为模板，设计特异性引物扩增获得。[0012]所述扩增片段tCBh的引物序列如下：
[0013]tCBh-F:5'-ACGAGCTGTACAAGTCTAGATAATCGAGGTGAGCCCCACGT-3'
[0014]tCBh-R:5'-TGCTCACCATGGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCCAACCTGAAAAAAAGTGATTTC-3'
[0015](2)慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro的构建：用XbaI 和BspMI酶切pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro载体回收大片段和tCBh片段进行无缝克隆得到。
[0016] 4.本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的慢病毒载体具有双启动子—CMV 和CBh，以绿荧光蛋白EGFP和mcherry作为报告基因，可以用现有的荧光显微镜装置检测，为进一步研究慢病毒载体感染细胞的感染效率提供了实验基础。
附图说明
[0017]附图1：慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro质粒图谱；[0018]附图2:Addgene采购的Multiplex CRISPR/Cas9Assembly System Kitprotocol中的pX330A-1x2质粒图谱；
[0019]附图3：慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro质粒图谱；[0020]附图4：片段tCBh扩增结果图；M:DNA Marker：DL2000，Lane1:PCR amplificationg of tCBh；
[0021]附图5：质粒pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro XbaI/BspMI双酶切凝胶回收结果；M:DNA Marker 1kb,Lane1:Digestion of plasmid pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro。
具体实施方式
[0022]以下涉及的化学试剂和生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范
围并不仅限于此：
[0023]实施例
[0024] 1.构建pLenti-EGFP-2A-Puro-CMV-tCBh慢病毒表达质粒
[0025] 1.1tCBh片段扩增：
[0026]以载体pX330A-1x2为模板，以tCBh-F和tCBh-R引物(SEQ ID No.1～2)对进行PCR 获得565bp的tCBh片段，切胶回收；
[0027]PCR体系如下：
[0028]
质粒模板(100ng/μl)2μl
Primer Star polymerase(3.5U/μl)0.5μl
dNTPs(10mM；2.5mM each)4μl
2X GC Buffer25μl
tCBh-F(10pmol/μl)1μl
tCBh-R(10pmol/μl)1μl
ddH2O16.5μl
[0029]PCR反应条件：
[0030]
[0031] 1.2使用XbaI和BspMI酶切pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro质粒，2h，37℃：
[0032]酶切体系如下：
[0033]
2μg(2μl)pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro
1μl XbaI(NEB)
1μl BspMI(NEB)
5μl NEBuffer3.1
41μl ddH2O
50μl合计
[0034]酶切后得到525bp和9244bp的片段，使用胶回收试剂盒纯化酶切后的9244bp的质粒大片段；
[0035] 1.3扩增得到的片段tCBh与酶切后的载体大片段无缝克隆成目的载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro。
[0036]体系如下：
[0037]
11.3ng插入片段(tCBh)
92.4ng线性化载体(pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro)
1μl无缝克隆酶
4μl5X反应Buffer
Up to 20μl ddH2O
[0038]混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。
[0039]将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。
[0040] 1.4挑取几个单菌落扩大培养并质粒小提。
[0041] 1.5鉴定质粒构建成功。测序正确的质粒即为所构建的目的质粒，命名为pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro。
[0042] 2.转染效率验证
[0043]用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃恒温培养293T细胞(购于美国ATCC细胞库)。取对数期细胞以1×105/孔接种到24孔板培养。待细胞融合度达到70％～8 0％时更换成Opti-MEM培养基，1小时后将pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro质粒0.8μg经Lipo2000试剂，转染到293T细胞中，转染48小时候，荧光显微镜下观察转
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