(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6
(22)申请日 2020.06.29
(71)申请人 贵州省水稻研究所
地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省
农科院水稻研究所
(72)发明人 闫志强 王晓雪 邓茹月 朱诉讼
尹燕斌 夏忠敏 宫彦龙 王忠妮
(74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理
有限公司 11262
代理人 陈丹 张奎燕
(51)Int.Cl.
G01N 21/64(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
C12N 15/65(2006.01)
A01G 7/00(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥
和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农
杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南
筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南
芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，
则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检
测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。该方法
简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选
效率。
权利要求书1页 说明书11页序列表6页 附图11页CN 111896506 A 2020.11.06
C N 111896506
A
1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：
步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；
步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；
步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；
步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；
步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；
步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光蛋白基因是绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(RFP)、黄荧光蛋白(YFP)、蓝荧光蛋白(BFP)以及它们的增强型荧光蛋白的基因，优选地，其中所述荧光蛋白基因是绿荧光蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述双元载体是pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pTCK303或pRGEB32载体，优选pCAMBIA1300载体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤2中，所述目标基因片段和所述经改造的双元载体具有双酶切位点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述双酶切位点分别是BamHI/SacI或smal/SacI的识别位点。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述农杆菌是农杆菌GV3101菌株。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述筛选培养基包含潮霉素，优选包含30mg/L潮霉素。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中观察所述植株的根部、幼叶、花瓣、子房、雄蕊或种子处的荧光。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述植株开花时观察花器官处的荧光，优选地观察花瓣、子房或雄蕊处的荧光。
权 利 要 求 书1/1页CN 111896506 A
一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法
技术领域
[0001]本发明涉及植物基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法。
背景技术
[0002]拟南芥是长日模式植物，具有植株形态个体小、生长周期短、结实多的特点，从播种到收获种子一般只需6周左右，每株植物可产生数千粒种子。因此，拟南芥被广泛用于植物遗传学研究。在反向遗传学领域，拟南芥更是起到了举足轻重的作用。例如，可以根据拟南芥的已知基因寻该基因在其它植物物种中的同源基因，通过构建超表达载体创建超表达突变体、下调表达突变体，或利用基因编辑创建基因敲除突变体，从而进行基因功能验证。目前很多生物学过程的调控通路在拟南芥中研究得相对透彻，因此，其它作物也会借鉴拟南芥已知的调控通路。用目标基因转化拟南芥，有助于对目标基因的功能及分子机理进行研究。
[0003]目前拟南芥转基因植株阳性植株的筛选主要是借助转基因载体中的潮霉素抗性基因进行筛选，但是拟南芥的种子量大，容易筛选到一定量的假阳性植株，继而不利地影响纯合植株的筛选以及接下来的基因功能研究。为了避免这种情况，通常会在移栽转基因拟南芥植株后，对其中的标记基因(例如β-葡萄糖苷酶基因(GUS)、潮霉素基因、目标基因等)进行分子水平检测，以明确每株转基因拟南芥植株的真伪。这个过程费时费力。
发明内容
[0004]为了克服现有技术的不足，本发明提供了荧光蛋白基因作为筛选标记基因在筛选转基因拟南芥阳性植株中的应用。
[0005]本发明通过对双元载体进行改造，将荧光蛋白(例如绿荧光蛋白，GFP)基因插入到双元载体中，借助转基因载体中的GFP的表达，在潮霉素抗性培养基筛选后、移栽植株前，通过显微镜直接观察拟南芥的部位(例如根部、花瓣或子房)进行GFP检测，从而筛选转基因拟南芥阳性苗。本发明提供的方法一方面可以排除潮霉素筛选中的假阳性苗，另一方面可以省去大规模提取DNA及分子水平检测所需的时间和精力。
[0006]在第一方面，本发明提供了一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：
[0007] 1.将目标基因片段插入到经改造的双元载体中；
[0008] 2.用步骤1中制备的双元载体转化农杆菌；
[0009] 3.用经转化的农杆菌转化拟南芥，并继续培养直到收获种子；
[0010] 4.将收获的种子播种在筛选培养基，以筛选转基因拟南芥阳性苗；
[0011] 5.出苗后，在荧光显微镜下观察拟南芥阳性苗的部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性苗，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性苗；
[0012]其中，所述经改造的双元载体能够表达荧光蛋白；
[0013]所述荧光蛋白是例如但不限于绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(RFP)、黄荧光蛋白(YFP)、蓝荧光蛋白(BFP)以及它们的增强型荧光蛋白，也可以是本领域普通技术人员熟知的其他荧光蛋白；在一些实施方案中，荧光蛋白是绿荧光蛋白；
[0014]优选地，双元载体的实例包括但不限于pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pTCK303和pRGEB32载体；在一些实施方案中，双元载体是pCAMBIA1300载体。
[0015]在一些实施方案中，目标基因的启动子和编码序列(CDS)通过在公开可得的数据库例如NCBI获得。接下来通过PCR或其他核酸扩增方法扩增目标基因。在一个具体实例中，PCR扩增反应体系如下(总计50μL)：
[0016]
[0017]目标基因片段的回收可以使用商购可得的回收试剂盒，例如OMEGA公司的胶回收试剂OMEGAD2500、天根生化科技公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒DP209或爱思进生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒AxygenAP-GX-250，按照制造商的说明进行。
[0018]在一些实施方案中，向回收的目标基因片段引入酶切位点，用于将目标基因片段插入到双元载体中。在一些优选实施方案中，向回收的目标基因片段引入双酶切位点。在一些优选实施方案中，可选的核酸内切酶选自BamHI/SacI或smal/SacI。在一些优选实施方案中，使用以下体系引入双酶切位点：
[0019]
[0020]在一些实施方案中，使用农杆菌转化拟南芥。在优选实施方案中，使用农杆菌菌株GV3101转化拟南芥的花序。转化后，继续培养拟南芥，收获种子。在一些实施方案中，将收获的种子播种在筛选培养基上，筛选转基因阳性苗。在一些优选实施方案中，所述筛选培养基包含潮霉素，优选30mg/L的潮霉素。
[0021]在一些实施方案中，选取在筛选培养基上生长的幼苗，观察其植物部位(例如根部、花瓣、子房、雄蕊、幼叶、种子)是否存在荧光。在优选实施方案中，观察植物部位的根部。在另一些优选实施方案中，在拟南芥开花时观察花器官，例如花瓣、子房或雄蕊处的荧光。[0022]在第二方面，本发明提供了一种经改造的双元载体及其制备方法，所述经改造的双元载体能够表达荧光蛋白。
[0023]在一些实施方案中，荧光蛋白是例如但不限于绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(RFP)、黄荧光蛋白(YFP)、蓝荧光蛋白(BFP)以及它们的增强型荧光蛋白，也可以使用本领域普通技术人员熟知的其他荧光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白是绿荧光蛋白。[0024]在一些实施方案中，双元载体的实例包括但不限于pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pTCK303和pRGEB32载体。在一些实施方案中，双元载体是pCAMBIA1300载体。
附图说明
[0025]附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。[0026]图1A-图1D分别是pCAMBIA1300载体、pBI101载体、本发明使用的加GFP标签的改造的pCAMBIA1300载体以及构建双元载体所用的pMD18-T载体的示意图。
[0027]图2A-图2B是实施例4的潮霉素筛选的结果。图2A是拟南芥转基因幼苗在潮霉素抗性培养基上筛选的结果。图2B是从抗性培养基上筛选出的转基因拟南芥阳性植株。[0028]图3A-图3B是实施例5的GFP筛选的结果。图3A是拟南芥转基因幼苗在无潮霉素抗性的培养基上的生长情况。图3B是根部GFP检测的结果。
[0029]图4A-图4C是实施例6的潮霉素联合GFP筛选的结果。图4A是拟南芥转基因幼苗在潮霉素抗性培养基上筛选的结果，箭头所指的为转基因阴性苗。图4B是对潮霉素筛选获得的转基因拟南芥阳性苗的根部进行GFP检测的结果。图4C是移栽后的幼苗的生长情况。[0030]图5A-图5C分别是对实施例4-6筛选出的转基因拟南芥阳性植株进行分子水平鉴定的结果。
[0031]图6是转基因拟南芥植株花瓣的GFP观察结果。
[0032]图7是转基因拟南芥雄蕊、幼叶、子房的GFP观察结果。
[0033]图8是转基因拟南芥种子的GFP观察结果。
[0034]图9是拟南芥花器官的结构的示意图。
具体实施方式
[0035]下面将通过实施例对本发明做进一步描述，这些描述并不是对本发明内容做进一步限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所做的等同替换，或相应改进，仍属于本发明的保护范围之内。
[0036]在第一方面，本发明提供了一种筛选转基因拟南芥阳性苗的方法，所述方法包括：[0037] 1.将目标基因片段插入到经改造的双元载体中；
[0038] 2.用步骤1中制备的双元载体转化农杆菌；
[0039] 3.用经转化的农杆菌转化拟南芥，并继续培养直到收获种子；
[0040] 4.将收获的种子播种在筛选培养基，以筛选转基因拟南芥阳性苗；
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