(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.04.24C N 103063783 A (21)申请号 201210541174.X
(22)申请日 2012.12.13
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/02(2006.01)
(71)申请人中国计量科学研究院
地址100013 北京市朝阳区北三环东路18
号
(72)发明人董莲华 孟盈 王晶 傅博强
高运华 张玲
(74)专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理
有限公司 11129
代理人张涛
(54)发明名称
(57)摘要
本发明首次建立了一种质粒DNA 定量检测用
为长度为200bp 以下的片段后，进行酶解，然后以
用高效液相谱-质谱分离单核苷酸并准确定
量。本发明提供了超声波处理质粒DNA 的优选条
件和高效液相谱法分离四种核苷酸的条件。本
方法精密度好，准确度高：采用核苷酸标准品，不
依赖于DNA 标准品，因此测量结果可溯源至核苷
酸有证标准物质，从而保证测量结果的可靠和可
溯源。由于用本方法可对质粒DNA 进行绝对定量，
可用于质粒DNA 定量检测用标准品的制备。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书16页 附图11页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书16页 附图11页(10)申请公布号CN 103063783 A
*CN103063783A*
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1.一种质粒DNA 定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA 进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA 经超声波处理成为长度为200bp 以下的片段，然后进行酶解。
2.权利要求1所述的方法，所述前处理条件为：
1）超声波处理：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：25min ，上样量为100μL ，DNA 浓度：10-50ng/μL ，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C ；
2）所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0.025U/μL ；
3）磷酸二酯酶水解质粒DNA 时间为100min 以上。
3.权利要求1所述的方法，酶解时使用磷酸二酯酶工作缓冲液，所述缓冲液的组成为：Tris-HCl100mM ，NH 4Ac10mM ，Mg(Ac)2300mM ，其中Tris-HCl 的pH 为8.8。
4.权利要求1所述的方法，所述酶解质粒DNA 样品体系组成为：磷酸二酯酶
5.0μL ，磷酸二酯酶工作缓冲液，超声处理的质粒DNA50μL ，同位素标记核苷酸LdNMP 混合液5.0μL 。
5.权利要求4所述的方法，所述同位素标记核苷酸混合液的制备方法是，加入13-C 、15－N 同位素的核苷酸，使溶液中同位素标记核苷酸含量与使质粒分子样品中dNMP 含量的比值接近1:1。
6.权利要求1所述的方法，所述高效液相谱分析中，谱条件为：流动相A ：20mM 醋酸铵，pH=3.5；流动相B ：乙腈。
7.权利要求1～6中任一所述的方法，磷酸二酯酶活性浓度为0.022U/μL 。
8.权利要求1～6中任一所述的方法，磷酸二酯酶水解质粒DNA 时间为120min 。权 利 要 求 书CN 103063783 A
质粒DNA定量检测用标准品的制备方法
技术领域：
[0001] 本发明属于生化分析领域，涉及一种可溯源的质粒DNA定量方法，具体涉及质粒DNA定量检测用标准品的制备方法。
背景技术
[0002] 质粒DNA是游离于染体外的小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。
[0003] 质粒DNA定量在分子生物学领域有广泛的需求，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA 的浓度进行准确测定。
[0004] 现有的测定DNA的技术虽然有些可以用于测定质粒DNA，但都有不足。有的需要的DNA样品量非常大，比如ICP-OES方法；有的成本较高，如digital PCR方法耗材太贵；有的准确度达不到要求，例如PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量时具有以下两个缺点：一是目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，一般是通过紫外吸收（OD260）确定的，不同厂家不同批次数值都不同，也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA 标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏
差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准（48.5K）。有报道称：以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。
[0005] 因为目前没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此需要要研制质粒DNA标准品。
[0006] 而得到质粒DNA标准品必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。[0007] 利用液相谱－同位素稀释质谱法(LC-IDMS)测定寡核苷酸的文献已有报道，是通过酶解寡核苷酸，测定水解后的单核苷酸浓度来测算核酸的浓度。然而，与寡核苷酸不同的是，单纯利用酶对基因组或质粒DNA进行完全水解非常困难。
[0008] 本发明人曾经通过将超声波处理结合酶解实现对基因组DNA（Lambda DNA）的定量（参见Analytical bioanalytical chemistry,2012，402，2079-2088.）。采用超声波+酶解+LC/MS方法；超声波强度为7，使用了两种酶，实现了对大片段的基因组DNA定量测定。[0009] 但是，该文章公开的方法测定的对象是分子量较大的基因组DNA，并不是质粒DNA。因为基因组DNA分子量更大，而且结构有差异，不象质粒DNA那样的环状，所以此方法的超声波条件、酶解条件等并不适用于质粒DNA定量。
发明内容：
[0010] 本发明的目的是提供一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，该方法应准确度高，精密度好，相对扩展不确定度2.3%。
[0011] 本发明首次建立了质粒DNA超声波-同位素稀释质谱定量方法，达到了上述发明目的。
[0012] 本发明的技术方案是：
[0013] 将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；
[0014] 其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后，进行酶解，条件为：
[0015] 1）所述超声波处理条件如下：强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；
[0016] 2）所述酶是磷酸二酯酶（SVP）；
[0017] 3）磷酸二酯酶的活性浓度为0.02-0.025U/μL，最佳活性浓度为0.022U/μL；[0018] 4）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上，最佳时间是120min。
[0019] 酶解时用磷酸二酯酶工作缓冲液将质粒样品制成溶液，所述缓冲液的组成为：[0020] Tris-HCl（pH=8.8)100mM，
[0021] NH4Ac 10mM，
[0022] Mg(Ac)2 2300mM
[0023] 酶解质粒DNA样品体系见表1：
[0024] 表1酶解质粒DNA样品体系组成
[0025]
成分μL/每次反应
SVP 5.0
SVP工作缓冲液 5.0
超声处理的质粒DNA50
同位素标记核苷酸LdNMP混合液5
[0026] 表中，同位素标记核苷酸（LdNMP）混合液的制备方法是，加一定量的13-C、15-N同位素标记的核苷酸标记物，使溶液中LdNMP含量与质粒分子样品中dNMP含量的比值接近1:1。
[0027] 高效液相谱分析中，谱条件为：流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。
[0028] 具体的，本发明人进行了如下研究工作：
[0029] 1．对超声波处理质粒DNA的条件进行了优化
[0030] 采用声波聚焦样本处理仪，对处理强度（intensity)、上样量、处理时间等进行了优化。优化结果见图1，其中2和3泳道为处理时间15min，处理强度5，4和5泳道为处理时间15min，处理强度为4；6和7泳道为处理时间25min，处理强度为5。由图可知，处理时间
25min，处理强度为5时，所得到的质粒DNA片段比较均匀，且小于200bp。因此最终确定的处理条件为强度：5；时间25min；上样量100μL；Duty Cycle：10%，Cycle per Burst：200，温度：4℃。DNA浓度范围：10-50ng/μl。
[0031] 2．对磷酸二酯酶酶解质粒样品的条件及体系进行了优化
[0032] 1）对磷酸二酯酶的浓度进行优化
[0033] 将磷酸二酯酶稀释成活性单位分别为0.010unit/μL、0.014unit/μL、0.018unit/μL、0.022unit/μL、0.026unit/μL以及0.030unit/μL共6个水平，每个水平3次平行的SVP稀释液。向50μL破碎后的质粒DNA中分别加入5μL SVP溶液及5μL SVP缓冲液。37℃进行酶解3h，然后85℃变性20min。4℃保存。利用4种dNMP标准物质做外标的高效液相谱（HPLC）对酶解样品进行分析（谱条件见下面第四点），确定单核苷酸的质量浓度，最大单核苷酸量对应的酶浓度即为酶解反应的最佳活性浓度，如图2所示，图中横坐标为SVP酶的活性浓度，即平均每微升的SVP溶液具有的酶活性单位数；纵坐标为4种单核苷酸相对于最大测定含量（设其值为1）时的相对百分含量。可见，在SVP酶的活性单位浓度在0.02-0.025U/μL之间时，4种单核苷酸的浓度分别达到最高。而达到0.025U/μL时4种单核苷酸的浓度反而降低，表明SVP酶过量对水解反应产生了抑制。因此，实验过程中最佳的解酶SVP酶的活性浓度确定为0.022U/μL。
[0034] 2）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间优化
[0035] 酶解时间分别为30、60、120、240及360min时，酶解反应依照最大化单核苷酸浓度进行优化的结果见图3。图中横坐标为SVP酶的酶解时间；纵坐标为4种单核苷酸相对于最大测定含量（设其值为1）
时的相对百分含量。当酶解时间从30min到60min时，4种单核苷酸的浓度呈上升趋势。当酶解时间为120min时，4中单核苷酸的浓度达到最高，此后的360min之内变化很小，因此可以认为在120min时达到了完全水解，所以最佳的酶解时间确定为120min。
[0036] 3．高效液相谱（HPLC）分离4种单核苷酸条件优化
[0037] 通过调整缓冲液的pH和盐浓度，对四种单核苷酸得到最大程度的分离。谱条件为：流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。进样量10μL，流速0.2mL/min。检测器：DAD，检测波长254nm。洗脱梯度见表2，分离结果见图2，其中横坐标为时间，纵坐标为DAD检测器的响应信号强度（毫吸光度mAu）。由图可知，4种单核苷酸标准物质的保留时间（按出峰先后顺序）分别为dCMP3.2min、dTMP4.7min、dGMP5.3min、dAMP6.8min。将酶解后的样品于12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。
[0038] 表2HPLC洗脱梯度
[0039]
[0040] 4.超声波处理结合酶处理对质粒DNA进行完全水解
[0041] 超声波处理后的质粒DNA进行磷酸二酯酶处理，酶解条件按照上述优化的条件进行，同时将不经超声波处理的质粒DNA直接进行酶解。采用高效液相谱对水解后的产物
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