(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010948452.8
(22)申请日 2020.09.10
(71)申请人 上海透景生命科技股份有限公司
地址 201203 上海市浦东新区中国（上海）
自由贸易试验区碧波路572弄115号1
幢
申请人 上海透景诊断科技有限公司
(72)发明人 欧赛英 朱丽
(74)专利代理机构 上海大视知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 31314
代理人 顾小伟
(51)Int.Cl.
G01N 33/576(2006.01)
G01N 33/569(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 21/76(2006.01)
(54)发明名称高灵敏度化学发光免疫诊断试剂及消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法(57)摘要本发明提供一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，第一和第二抗原用于特异性结合待检测样本中的待检测抗体，第一和第二抗体用于特异性结合待检测样本中的待检测抗原。较佳地，第一和第二抗体均为HIV anti ‑protein24或抗‑HBsAg抗体。第一和第二抗原均为HIV ‑I型融合抗原和HIV ‑II型抗原、或者HCV融合抗原。化学发光试剂是吖啶酯或吖啶磺酰胺。还提供了一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法。本发明的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂能够大幅度提高免疫诊断试剂灵敏度，提高 检测准确性。权利要求书1页 说明书16页 附图5页CN 112098651 A 2020.12.18
C N 112098651
A
1.一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其特征在于，包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，所述第一抗原和所述第二抗原用于特
异性结合待检测样本中的待检测抗体，所述第一抗体和所述第二抗体用于特异性结合待检测样本中的待检测抗原。
2.如权利要求1所述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其特征在于，所述第一抗体和所述第二抗体均为HIV anti-protein24或抗-HBsAg抗体。
3.如权利要求1所述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其特征在于，所述第一抗原和所述第二抗原均为HIV-I型融合抗原和HIV-II型抗原、或者HCV融合抗原。
4.如权利要求1所述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其特征在于，所述化学发光试剂是吖啶酯或吖啶磺酰胺。
5.一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特征在于，采用根据权利要求1所述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法包括以下步骤：
(1)将所述的包被有第一抗原/第一抗体的磁珠与待检测样本进行第一步反应；
(2)洗涤后加入所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂进行第二步反应，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂预先添加所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体。
6.如权利要求5所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特征在于，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体的浓度稀释20倍～80倍。
7.如权利要求5所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特征在于，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HIV-I抗原生物素和HIV-II抗原生物素，所述HIV-I抗原生物素的浓度为0.5/2500mg/ml，所述HIV-II抗原生物素的浓度为0.38/5000mg/ml。
8.如权利要求5所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特征在于，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HCV抗原生物素，所述HCV 抗原生物素的浓度为0.8/2000mg/ml。
9.如权利要求5所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特征在于，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HBsAg多抗生物素，所述HBsAg多抗生物素的浓度为0.78/2000mg/ml。
权 利 要 求 书1/1页CN 112098651 A
高灵敏度化学发光免疫诊断试剂及消除两步法免疫试剂HOOK
效应的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物化学技术领域，特别涉及免疫诊断技术领域，具体是指一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂及消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法。
背景技术
[0002]免疫分析技术经历了酶免分析技术(EIA)、放射免疫分析技术(RIA)、荧光免疫分析技术(FIA)、时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)和化学发光免疫分析技术(CLIA)几个阶段。其中，CLIA作为最先进的免疫分析技术，不仅自动化程度高、检测速度快，而且还具有较高的灵敏度和分析特异性，在临床检测中发挥着越来越重要的作用。
[0003]临床上对免疫试剂灵敏度要求越来越高，尤其是传染病检测试剂，灵敏度越高，就越能更早检测出感染状况，所以提高试剂的灵敏度一直是体外诊断试剂厂商所追求的一大目标。
[0004]众所周知，(链霉)亲和素-生物素是免疫检测中常用的信号放大系统。亲和素是蛋清中常见的糖蛋白，由四个相同亚基组成，每一个亚基都包含一个生物素结合位点，因此理论上一个亲和素能结合四个生物素。亲和素与生物素之间具有强烈的亲和力，其解离常数约1.3*1015mol/L，是自然界中最强的非共
价相互作用之一，远高于抗原-抗体之间的亲和力(5*105-11mol/L)。而且，亲和素稳定性很好，即使在浓度高达8M的尿素溶液中，也能保持结构的完整性和对生物素的亲和力。另外，亲和素-生物素系统结合具有高度特异性，能够在复杂溶液环境中互相结合。因此，亲和素-生物素系统广泛应用在免疫检测中，其中应用最为广泛的就是将链霉亲和素包被在磁珠表面，生物素标记抗原/抗体，链霉亲和素和生物素结合，作为固相使用，这样的固相系统由于固相空间上延伸出一个亲和素-生物素系统，故而更接近液相中的均相反应，因而试剂精密性更高；另外包被工艺本身比生物素标记工艺复杂，所以链霉亲和素的通用固相能简化工艺。罗氏Elecys电化学发光绝大部分免疫试剂，西门子Centaur系统一部分免疫试剂，以及贝克曼Access/DXI系统一部分免疫试剂，均采用链霉亲和素-生物素系统做固相系统；国内体外诊断试剂中苏州长光华医、迪瑞生物等多家企业均采用链霉亲和素-生物素磁珠系统，可见这一系统在免疫诊断试剂中应用相当成熟。[0005]然而发明人发现，可能是由于固相空间位阻的缘故，链霉亲和素-生物素磁珠免疫诊断试剂并没有呈现理论上的指数级信号放大效果；但是应用于免疫试剂后端时，通常会出现指数级的信号放大效果，因而可以应用于提高标记免疫分析试剂的灵敏度上，尤其是可以应用于一些对灵敏度要求高的标记免疫试剂，如人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂(anti-HIV)、人类丙型肝炎病毒抗体检测试剂(anti-HCV)等。但是，由于一些人体内会产生极高浓度的抗体，比如一些HIV阳性孕妇的抗体浓度极高，而双抗原夹心法测抗体如果搭配后端链霉亲和素-生物素放大体系，客户端要求快速出结果，这就需要两端抗原和样本中的抗体在第一步反应，链霉亲和素标记物放在第二步反应，抗体浓度太高，会导致强阳样本可能由于HOOK效应检测成阴性，因此，有必要改善链霉亲和素-生物素后端放大体系在两步
法操作中由于HOOK效应带来的漏检风险。
[0006]因此，希望提供一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其能够大幅度提高免疫诊断试剂灵敏度，提高检测准确性，还希望提供一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其可以确保强阳样本不漏检，提高检测准确性。
发明内容
[0007]为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其能够大幅度提高免疫诊断试剂灵敏度，提高检测准确性，适于大规模推广应用。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其设计巧妙，配制简便，成本低廉，适于大规模推广应用。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其可以确保强阳样本不漏检，提高检测准确性，适于大规模推广应用。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
[0011]为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，其特点是，包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，所述第一抗原和所述第二抗原用于特异性结合待检测样本中的待检测抗体，所述第一抗体和所述第二抗体用于特异性结合待检测样本中的待检测抗原。
[0012]较佳地，所述第一抗体和所述第二抗体均为HIV anti-protein24或抗-HBsAg抗体。
[0013]较佳地，所述第一抗原和所述第二抗原均为HIV-I型融合抗原和HIV-II型抗原、或者HCV融合抗原。
[0014]较佳地，所述化学发光试剂是吖啶酯或吖啶磺酰胺。
[0015]在本发明的第二方面，提供了一种消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，其特点是，采用上述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，所述的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法包括以下步骤：
[0016](1)将所述的包被有第一抗原/第一抗体的磁珠与待检测样本进行第一步反应；[0017](2)洗涤后加入所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂进行第二步反应，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂预先添加所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体。[0018]较佳地，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体的浓度稀释20倍～80倍。[0019]较佳地，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，
所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HIV-I抗原生物素和HIV-II抗原生物素，所述HIV-I抗原生物素的浓度为0.5/2500mg/ ml，所述HIV-II抗原生物素的浓度为0.38/5000mg/ml。
[0020]较佳地，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HCV抗原生物素，所述HCV抗原生物素的浓度为0.8/2000mg/ml。
[0021]较佳地，所述的链霉亲和素标记的化学发光试剂是链霉亲和素-吖啶酯试剂，所述链霉亲和素-吖啶酯试剂的浓度为0.45/4000mg/ml，所述的生物素标记的第二抗原/第二抗体是HBsAg多抗生物素，所述HBsAg多抗生物素的浓度为0.78/2000mg/ml。
[0022]本发明的有益效果主要在于：
[0023]1、本发明的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，第一抗原和第二抗原用于特异性结合待检测样本中的待检测抗体，第一抗体和第二抗体用于特异性结合待检测样本中的待检测抗原，即采用后端链霉亲和素-生物素放大体系，因此，其能够大幅度提高免疫诊断试剂灵敏度，提高检测准确性，适于大规模推广应用。
[0024]2、本发明的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，第一抗原和第二抗原用于特异性结合待检测样本中的待检测抗体，第一抗体和第二抗体用于特异性结合待检测样本中的待检测抗原，即采用后端链霉亲和素-生物素放大体系，因此，其设计巧妙，配制简便，成本低廉，适于大规模推广应用。
[0025]3、本发明的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，采用上述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，包括以下步骤：将包被有第一抗原/第一抗体的磁珠与待检测样本进行第一步反应；洗涤后加入链霉亲和素标记的化学发光试剂进行第二步反应，链霉亲和素标记的化学发光试剂预先添加生物素标记的第二抗原/第二抗体，因此，其可以确保强阳样本不漏检，提高检测准确性，适于大规模推广应用。
[0026]4、本发明的消除两步法免疫试剂HOOK效应的方法，采用上述的高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，包括以下步骤：将包被有第一抗原/第一抗体的磁珠与待检测样本进行第一步反应；洗涤后加入链霉亲和素标记的化学发光试剂进行第二步反应，链霉亲和素标记的化学发光试剂预先添加生物素标记的第二抗原/第二抗体，因此，其设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
[0027]本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
[0028]图1是双抗体夹心法测p24抗原的直接包被直接标记模式的反应示意图。[0029]图2是双抗体夹心法测p24抗原的直接包被间接标记模式的反应示意图。[0030]图3是双抗体夹心法测p24抗原的间接包被直接标记模式的反应示意图。[0031]图4是双抗原夹心法测抗体的直接包被间接标记模式的漏检反应示意图。[0032]图5是双抗原夹心法测抗体的直接包被间接标记模式的确保强阳样本不漏检的测试方法的示意图。
具体实施方式
[0033]为了大幅度提高免疫诊断试剂灵敏度，提高检测的准确性，本发明提供了一种高灵敏度化学发光免疫诊断试剂，包括：包被有第一抗原/第一抗体的磁珠、生物素标记的第二抗原/第二抗体、以及链霉亲和素标记的化学发光试剂，所述第一抗原和所述第二抗原用
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