(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911065794.9
(22)申请日 2019.11.04
(71)申请人 百世诺（北京）医疗科技有限公司
地址 102206 北京市昌平区中关村生命科
学园北大医疗产业园14号楼501
(72)发明人 刘哲 侯青 梁庆渊 刘锋
李伟真 刘福佳 赵娜娜 周小云
刘昕超 惠汝太
(74)专利代理机构 北京精金石知识产权代理有
限公司 11470
代理人 张黎
(51)Int.Cl.
C12N 15/12(2006.01)
C12Q 1/6883(2018.01)
C12Q 1/6858(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种突变基因及其用途，它是
人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异，以及 该变异作为Liddle综合征的分子标记的用途。还
提供了检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺
失变异的相关试剂在制备Liddle综合征的检测
试剂中的用途。本发明将SCNN1B基因c.1849delC
杂合缺失变异应用于Liddle综合征基因检测试
剂盒的制备中，
能达到临床辅助诊断的目的。权利要求书1页 说明书7页 附图1页CN 110656112 A 2020.01.07
C N 110656112
A
1.一种SCNN1B突变基因，其特征在于，包含人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异。
2.权利要求1所述的SCNN1B突变基因在制备Liddle综合征的检测试剂中的用途。
3.检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂在制备Liddle综合征的检测试剂盒中的用途。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂盒为基因检测试剂盒。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂为测序试剂。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂为Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性方法用试剂、单链构象多态性分析用试剂和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交用试剂中的一种或多种。
7.一种Liddle综合征基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括任选的用于检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂为测序试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的试剂为Sanger测序试剂。
10.一种使用Sanger测序法对权利要求1所述突变基因进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)使用经设计的引物组合对SCNN1B基因进行扩增；
(2)将扩增产物经纯化磁珠进行纯化；
(3)纯化后的PCR产物进行Sanger测序；(4)测序结果分析。
权 利 要 求 书1/1页CN 110656112 A
一种Liddle综合征基因检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体提供一种Liddle综合征基因检测试剂盒。
背景技术
[0002]Liddle综合征又称假性醛固酮增多症，是1963年Liddle等首先报告，故称为Liddle综合征。本病的典型临床表现包括受基因外显率和其他因素的影响而差异较大，约50％的患者存在高血压而血钾正常，另有患者血压正常而血钾偏低，亦有部分隐匿起病的患者血压及血钾水平均正常。临床症状与醛固酮增多症相似，但醛固酮分泌率很低，且螺内酯无效，对氨苯蝶啶或限盐有效。Liddle综合征多为家族性，也存在家族史阴性的散发病例。本病的病变部位在集合管，对钠重吸收增加，排钾泌氢增多，属全身性遗传性钠转运异常性疾病。Liddle综合征是常染体显性遗传疾病，由编码上皮细胞钠通道蛋白β、γ亚单位的SCNN1B和SCNN1G基因突变导致，目前研究显示2种基因的致病突变均集中于13号外显子。致病基因突变导致上皮细胞钠通道蛋白无法与泛素连接酶结合，不能正常降解，最终引起钠水潴留、血压升高、血钾降低、肾素和醛固酮分泌受抑制，而出现一系列临床症状。
[0003]对于Liddle综合征的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影像学检查。这些手段存在很大的缺点：1.检查种类多；2.灵敏度和特异度低；3.易受药物和精神状况等因素的影响；4.检测时间要求苛刻。目前，基因检测是确诊Liddle综合征的重要手段，基于该疾病的罕见性，因此，任何一个或一组Liddle综合征的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。现有技术“一个Liddle综合征患者的SCNN1B基因新突变及其临床随访研究，杨坤璂等，中国循环杂志，2015年8月，第30卷增刊”公开记载了对一年轻患者的SCNN1B基因检测发现了一个杂合移码突变p.Asn619Glnfs*3，即在第617密码子和第618密码子之间插入了一个胞嘧啶，导致第621密码子变为终止密码子，引起末尾20个氨基酸的缺失。现有技术“Liddle综合片患者的基因型、表型分析及随访研究，王林平等，中国分子心脏病学杂质，2011,11(3)”记载了在SCNNIB基因的第13号外显子上发现了两个错义突变P614L 和P616S。
[0004]本发明提供一个新的SCNN1B基因的变异位点，及其检测试剂盒，用于临床(辅助)诊断Liddle综合征，为携带Liddle综合征致病变异的家庭提供遗传阻断，提高优生优育质量。
[0005]其他参考背景技术：
[0006][1]中华医学会心血管病学分会精准心血管病学学组，中国医疗保健国际交流促进会，精准心血管病分会,et al.单基因遗传性心血管疾病基因诊断指南[J].中华心血管病杂志,2019,47(3):175-196.
发明内容
[0007]本发明通过对Liddle综合征的家系成员进行分析，意料不到地发现了：家系中的
Liddle综合征患者具有SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异，家系中的未患病成员均未检测到该变异，说明该变异与Liddle综合征密切相关。
[0008]以上发现通过相当数量的无关样本得以验证，基于Liddle综合征的患病罕见性，样本包括200名表型健康的对照成员和1例Liddle综合征的患者成员。经验证：200名表型健康的对照成员均未检测到该变异；1例Liddle综合征的患者成员检测到SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异。
[0009]进一步扩大阴性样本数量，在扩大至1127名的随机的表型健康的对照成员的志愿者样本范围内，均未检测到该变异。
[0010]进一步扩大阳性样本数量，在扩大至3名的随机患者成员的志愿者样本范围内，均检测到该变异。
[0011]以上，说明该变异能够用于Liddle综合征的检测。
[0012]基于上述发现，本发明所要解决的技术问题是，提供一个新的Liddle综合征相关的致病基因变异，同时提供该变异的检测方法和试剂盒，以及它们在临床辅助诊断Liddle 综合征中的用途。
[0013]首先，本发明提供了一种突变基因，所述变异为SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异(SCNN1B:
p.P617fs het)。查询人频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人。该变异致1849位碱基缺失，会使蛋白阅读框发生改变，并可能会在其后的第15个氨基酸处提前出现一终止密码子。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中保守性好。查询ClinVar数据库、HGMD及文献检索未发现该变异与疾病相关的文献报导，但发现该位置碱基的其他变异:c.1849C>T(P617S)被上报者评定为“Pathogenic”，文献检索发现该位点附近的变异p.P616L、p.P617H/S、p.P618R/H/S、p.Y620H等均曾被报导与Liddle综合症有关，提示该位置氨基酸可能位于蛋白的重要功能区。
[0014]本发明还提供了检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂在制备Liddle综合征基因检测试剂中的用途。
[0015]如前述的用途，所述的试剂包括检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类SCNN1B基因编码区第1848-1850位碱基的核酸片段的相关试剂。
[0016]如前述的用途，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的方法包括但不限于现有技术中对基因变异位点的任何可选检测方法：例如Sanger测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)。[0017]如前述的用途，包括但不限于对人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异进行定性和/或定量检测。
[0018]如前述的用途，所述的定量检测包括但不限于现有技术中对基因的任何可选检测方法，例如荧光定量PCR。
[0019]如前述的用途，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂为测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
[0020]本发明还提供了一种Liddle综合征的基因检测试剂盒，它包括任选的用于检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂。
[0021]如前述的试剂盒，所述的试剂包括检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类SCNN1B基因编码区第1848-1850位碱基的核酸片段的相关试剂。
[0022]如前述的试剂盒，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂为测序试剂。
[0023]如前述的试剂盒，所述检测人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异的相关试剂包括但不限于现有技术中对基因变异位点的任何可选检测试剂：例如Sanger测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)的检测试剂。
[0024]如前述的试剂盒，包括但不限于对人类SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异进行定性和/或定量检测试剂。
[0025]如前述的试剂盒，所述的定量检测试剂包括但不限于现有技术中对基因的任何可选检测试剂，例如荧光定量PCR检测试剂。
[0026]本发明的另一目的在于使用Sanger测序法对该变异进行检测，包括如下步骤：[0027](1)使用经设计的引物组合对SCNN1B基因进行扩增；
[0028](2)将扩增产物经纯化磁珠进行纯化；
[0029](3)纯化后的PCR产物进行Sanger测序；
[0030](4)测序结果分析。
[0031]具体地，所述步骤(1)中采用的PCR扩增引物序列如下：
[0032]
[0033]本发明具有以下有益效果
[0034] 1.本发明提供的SCNN1B基因c.1849delC杂合缺失变异可以将Liddle综合征患者和正常人区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断Liddle综合征的生物标志物。[0035] 2.通过检测受试者是否携带上述变异，可以检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。
[0036] 3.为人类攻克Liddle综合征提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。
附图说明
[0037]图1是Liddle综合征家系图；
[0038]图2是家系中对照及本地数据库中对照的Sanger测序图；
[0039]图3是患者的Sanger测序图。
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