(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.05.08C N 103088135 A (21)申请号 201310024568.2
(22)申请日 2013.01.23
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人厦门大学
地址361000 福建省厦门市思明南路４２２
号
申请人厦门致善生物科技有限公司
(72)发明人李庆阁 黄秋英 夏众敏 杨蓉
(74)专利代理机构厦门市首创君合专利事务所
有限公司 35204
代理人张松亭
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基
因突变荧光PCR 熔解曲线检测试剂盒。本发明的
种突变的检测，PCR 扩增结束经一次荧光PCR 熔解
曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3
小时即可完成，操作步骤少，耗时短，通量高，
且检测位点多，突变覆盖率高；此外本发明的试剂盒
采用均相检测、闭管操作，减少了PCR 产物污染的
可能性，且检测特异性高，结果容易判读。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书6页
序列表4页 附图4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书6页序列表4页 附图4页(10)申请公布号CN 103088135 A
*CN103088135A*
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：
特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T和c.1388G>A所在序列的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，R1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F3的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，R3的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；
特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F4的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，R4的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；
特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T和c.592C>T所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，R5的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；
以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。
2.如权利要求1所述的一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述荧光探针包括：
用于检测突变位点c.1360C>T的荧光探针P1，其碱基序列如SEQ ID NO：11所示；
用于检测突变位点c.871G>A的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO：12所示；
用于检测突变位点c.1004C>A和c.1024C>T的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ ID NO：13所示；
用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A的荧光探针P4，其碱基序列如SEQ ID NO：14所示；
用于检测突变位点c.95A>G的荧光探针P5，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示；
用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T的荧光探针P6，其碱基序列如SEQ ID NO：16所示；
用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G的荧光探针P7，其碱基序列如SEQ ID NO：17所示；
用于检测突变位点c.517T>C和c.519C>T的荧光探针P8，其碱基序列如SEQ ID NO：18所示；
用于检测突变位点c.592C>T的荧光探针P9，其碱基序列如SEQ ID NO：19所示。
3.如权利要求2所述的一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述荧光探针5’端的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL FlourOrange560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705，所述荧光探针3’端的淬灭基团包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。
4.如权利要求1所述的一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括检测体系A和检测体系B，
所述检测体系A包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μMdNTP、2.5mM MgCl
、
2上游引物F1、F2各1pmol、下游引物R1、R2各5pmol及荧光探针P1、P2、P3、P4各5pmol；
所述检测体系B包括1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl
、
2上游引物F3、F4、F5各1pmol、下游引物R3、R4、R5各5pmol及荧光探针P5、P6、P7、P8、P9各5pmol；
上述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.510mM、KCl50mM和50%（v/v）甘油。
5.如权利要求1所述的一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，其特征在于：所述检测体系A和检测体系B的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：（1）50℃2min，95℃10min；
（2）95℃15s→65℃~56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65℃~56℃15s每个循环下降1℃；
（3）95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环，在55℃退火阶段采集荧光信号；
（4）95℃1min→35℃3min→40℃~85℃，其中40℃~85℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。
一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检
测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用荧光PCR熔解曲线分析检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。
背景技术
[0002] 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD deficiency)是最常见的人类酶缺陷病之一，其病因是G6PD基因突变导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶合成减少。然而，绝大部分患者的生活质量并没有因此降低，这主要是由于在我国出现的绝大部分G6PD缺乏症患者只有在诱因的存在下才会出现相应的临床症状，因此，完全可以通过预先防范和及时接受正确的而有效的避免上述情况的发生。所以在我国G6PD缺乏症的高发区进行全民筛查是十分必要的。
[0003] 目前G6PD缺乏症的临床诊断方法包括生化检测方法和分子生物学检测方法，其中生化筛查是传统诊断方法，通过直接或者间接地测定G6PD的酶活性来筛查G6PD缺乏症的携带者和患者。主要包括进行定性检测的高铁血红蛋白还原试验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝（NBT）纸片法和进行定量检测的NBT定量法、NADPH定量比值法等。分子生物学方法是基于DNA的分析进行G6PD基因突变的检测，如反向点杂交（RDB）、PE/DHPLC、AS-PCR、PCR-SSCP、基因芯片等。生产厂家主要有杭州纽罗西敏生物科技有限公司和Solgent有限公司等。国内临床常用的方法为检测酶活性的生化检测法和反向点杂交法。
（1）对女性杂合[0004] 生化检测方法虽然检测成本低、检测时间短，但其存在以下缺点：
（2）结果易受实验条件，操作人员等因素影响。
子的检出率低，仅为20~45%左右；
[0005] 现有的分子检测方法虽然能较好地解决G6PD缺乏症女性杂合子检测的问题，但是不同的方法有着自身的局限性。反向点杂交法是一种异相的突变检测方法，需要对PCR 产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响。PE/ DHPLC对仪器要求设备高，应用性不强。AS-PCR检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发生。PCR-SSCP对实验条件要求严格，只能检测突变是否存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序。此外，由于某些点突变类型对单链DNA的空间构象改变小，容易漏检。基因芯片技术不但成本高、操作复杂而且结果存在不同程度的假阳性。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种应用荧光PCR熔解曲线分析检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，该试剂盒包括：
[0009] 特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T和c.1388G>A所在序
列的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，R1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
[0010] 特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，R2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
[0011] 特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F3的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，R3的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；
[0012] 特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F4的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，R4的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；[0013] 特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T和c.592C>T所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，R5的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；
[0014] 以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。
[0015] 在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光探针包括：
[0016] 用于检测突变位点c.1360C>T的荧光探针P1，其碱基序列如SEQ ID NO：11所示；[0017] 用于检测突变位点c.871G>A的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO：12所示；[0018] 用于检测突变位点
c.1004C>A和c.1024C>T的荧光探针P3，其碱基序列如SEQ ID NO：13所示；
[0019] 用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A的荧光探针P4，其碱基序列如SEQ ID NO：14所示；
[0020] 用于检测突变位点c.95A>G的荧光探针P5，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示；[0021] 用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T的荧光探针P6，其碱基序列如SEQ ID NO：16所示；
[0022] 用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G的荧光探针P7，其碱基序列如SEQ ID NO：17所示；
[0023] 用于检测突变位点c.517T>C和c.519C>T的荧光探针P8，其碱基序列如SEQ ID NO：18所示；
[0024] 用于检测突变位点c.592C>T的荧光探针P9，其碱基序列如SEQ ID NO：19所示。[0025] 在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光探针5’端的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL FlourOrange560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705，所述荧光探针3’端的淬灭基团包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。[0026] 在本发明的一个优选实施方案中，该试剂盒包括检测体系A和检测体系B，[0027] 所述检测体系A包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μMdNTP、2.5mM 、上游引物F1、F2各1pmol、下游引物R1、R2各5pmol及荧光探针P1、P2、P3、P4各MgCl
2
5pmol；
[0028] 所述检测体系B包括1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl
、上游引物F3、F4、F5各1pmol、下游引物R3、R4、R5各5pmol及荧光探针P5、P6、P7、2
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