[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1472308A [43]公开日2004年2月4日
[21]申请号02125920.8[21]申请号02125920.8
[22]申请日2002.08.02[71]申请人中国农业大学
地址100094北京市圆明园西路二号
[72]发明人姜伟 付刚 李颖 田杰生 王珍芳 李季
伦 [74]专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司代理人张广育
[51]Int.CI 7C12N 1/20
权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 3 页
[54]发明名称
养基
[57]摘要
本发明提供一种使用趋磁细菌生产磁性颗粒的
方法,包括以下步骤:在含有碳源、氮源和铁源的
培养基中通过深层培养法在25℃~35℃下培养趋磁
细菌,其中培养基中碳氮比为4∶1~15∶1,pH值
控制在7.0~7.8之间,氧分压控制在0.5%~21%
之间,菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生
磁颗粒;然后收集菌体并提取磁颗粒。本发明还涉
及培养趋磁细菌的培养基。
02125920.8权 利 要 求 书第1/2页 1.使用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法,包括以下步骤: 在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在25℃~35℃下培养趋磁细菌,其中培养基中碳氮比为4∶1~15∶1,pH值控制在7.0~7.8之间,氧分压控制在0.5%~21%之间,菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒;然后收集菌体并提取磁颗粒。
2.权利要求1的方法,其中培养基中使用的碳源是有机酸或者有机酸盐。
3.权利要求2的方法,其中培养基中使用的碳源是乳酸钠。
4.权利要求1的方法,其中培养基中使用的氮源是硝酸盐或铵盐。
5.权利要求4的方法,其中培养基中使用的氮源是氯化铵。
6.权利要求1的方法,其中培养基中使用的铁源是喹啉酸铁。
7.权利要求1的方法,其中氧分压在菌体生长阶段控制在5~10%,磁颗粒生产阶段控制在1%~3%。
8.权利要求1的方法,其中培养基中碳氮比为10∶1。
9.权利要求1的方法,其中在深层培养之前,先在振荡条件下培养趋磁细菌,获得种子培养液。
10.一种用于趋磁细菌培养的培养基,其组成如下:
乳酸钠(60%-70%) 6.5g
NH4Cl 1.0g
Fe3+(喹啉酸铁) 80μM
酵母粉 0.1g
K2HPO4 0.5g
硫代乙醇酸钠 0.05g
MgSO4·7H2O 0.1g
维生素混合液 10ml
矿质元素混合液 5ml
蒸馏水 至1000毫升 其中,维生素混合液的组成如下:
生物素(Biotin) 2mg
02125920.8权 利 要 求 书 第2/2页 叶酸(Folic acid) 2mg 盐酸吡哆辛(Pyridoxine-HCl) 10mg 盐酸硫胺素(T h i a m i n e-H C l·2H2O) 5m g 核黄素(R i b o f l a v i n) 5m g 烟酸(Nicotinic acid) 5mg 泛酸钙(D-C a-p a n t o t h e n a t e) 5m g 维生素B12(Vitamin B12) 0.1mg 对-氨基苯甲酸(p-A m i n o b e n z o i c a c i d) 5m g 硫辛酸(L i p o i c a c i d) 5m g 蒸馏水 至1000ml 矿质元素混合液的组成如下:
氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid) 1.5g 硫酸镁(M g S O4·7H2O) 3.0g 硫酸锰(M n S O4·2H2O) 0.5g 氯化钠(NaCl) 1.0g 硫酸铁(F e S O4·7H2O) 0.1g 硫酸钴(C o S O4·7H2O) 0.18g 氯化钙(C a C l2·2H2O) 0.1g 硫酸锌(Z n S O4·7H2O) 0.18g 硫酸铜(C u S O4·5H2O) 0.01g 硫酸铝钾(K A l(S O4)2·12H2O) 0.02g 硼酸(H3B O3) 0.01g 钼酸钠(N a2M o O4·2H2O) 0.01g 氯化镍(NiCl2·6H2O)
0.025g 亚硒酸钠(N a2S e O3·5H2O) 0.3m g 蒸馏水 至1000ml
02125920.8说 明 书第1/10页用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法及其中使用的培养基
技术领域
本发明涉及利用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法。这种方法通过在控制的条件下使趋磁细菌快速生长并在细胞内合成磁性颗粒,从而获得细菌磁性颗粒。本发明还涉及培养趋磁细菌的培养基。
背景技术
细菌磁颗粒是由趋磁细菌合成的一种F e3O4颗粒,在细胞内逐步合成并沿磁力线排列成链状。它们颗粒大小均匀、一般直径为纳米级(40~50n m),并具有稳定晶型。每个磁颗粒都有脂蛋白膜包被,因此被称为磁小体(m a g n e t o s o m e)。经研究发现,细菌磁颗粒在医学、生物技术等领域具有十分广泛的应用前景,它的应用主要表现在以下几个方面:
1)作为固定化酶载体和生物传感器的组成部分
M a t s u n a g a等(1987)将葡萄糖氧化酶和脲酶分别固定在细菌磁颗粒、人造磁粒和Z n-F e颗粒上制成
磁化酶,发现,同样的酶量在细菌磁颗粒上和人造磁粒的固定量分别是Z n-F e颗粒固定量的100倍和40倍。连续使用5次后,细菌磁颗粒固定的酶活力变化不大,而人造磁粒和Z n-F e颗粒固定的酶活则明显降低。说明被细菌磁颗粒所固定的酶具有稳定、高效等特点。另外,有人试验将葡萄糖氧化酶和脲酶固定在这种磁性颗粒上,作为葡萄糖和尿酸生物传感器的组成部分,也在医学诊断上具有重要意义。
2)连接抗体用于快速、高灵敏度的免疫检测
利用戊二醛处理后的磁小体,每毫克可偶联29微克的抗体。因此有人利用抗S C C(扁皮细胞癌)抗体连接视频监测系统,可检测S C C 抗原。当有S C C抗原存在时,由于抗原抗体结合可使磁颗粒聚集在监测系统而反映出来,这种方法的检测限可达到1.5n g/m l的水平。 此技术还可以用于荧光免疫测定。如图1所示,用F I T C-抗老鼠抗原抗体-磁小体复合物测定老鼠的I g G。M a t s u n a g a T等(1999)利用基因工程技术在M a g n e t o s p i r l l u m s p.A M B-1中合成磁小体的关键基
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因m a g A和它的启动子之间插入P r o t e i n A基因,得到了在磁小体表面表达有ProteinA蛋白的磁小体,建立了用磁小体-ProteinA复合物快速高灵敏度地测定人I g G的化学发光酶免疫测定方法,用这种方法检测IgG的最低浓度为1ng/ml。
3)制备磁性细胞和纯化某些难以纯化的细胞产物
利用趋磁细菌和某些有特殊功能的细胞融合,从而使这种具有特殊功能的细胞带有磁性,利用外加磁场的磁导向作用使之定向地行使其功能。例如,当有免疫活性的细胞与磁细菌融合后,具有趋磁性,它可能在外加磁场的作用下定向地攻击肿瘤细胞。M a t s u n a g a T等1987年成功的用聚乙二醇作融合剂,使趋磁细菌与绵羊的红细胞融合,因而使绵羊的红细胞具有趋磁性。M a t s u n a g a T等又于1989年利用人体白细胞的吞噬作用将趋磁细菌导入了粒细胞和单核白细胞,每个粒细胞和单核白细胞可以吞噬20-40个趋磁细菌,利用S m-C o磁铁收集除去这些具有趋磁性的细胞,就可得到污染率极低的淋巴细胞。依据这种原理,M a t s u n a g a T(1991)利用磁场控制来回收和纯化产生干扰素的细胞也获得成功。
4)用于基因转移
利用载有D N A和R N A的微发射物进行基因转移的技术近年发展较快。人们发现细菌磁小体比钨、金或人造磁粒可更多地吸附D N A或R N A,同时用粒子转移而获得某一基因的细胞可以方便地利用S m-C o 磁铁选择性的分离,从而使细菌磁小体作为一名自然的侯选者应用于这一生物技术领域。M a t s u n a g a T等(1995)用细菌磁性颗粒作为D N A 的载体进行了海洋蓝细菌的弹道转化,经S o u t h e r n杂交和C A T测定表明,外源基因已被成功导入受体细胞,并得以表达。此外,细菌磁性颗粒还可用于mRNA的分离。
5)作为药物的载体用于肿瘤的靶向定位
利用人造磁性颗粒F e3O4作为载体与药物混合制备的磁物制剂,在足够强的体外磁场作用下注入血管,定位于肿瘤靶区,药物以受控的方式从载体中逐步释放,攻击肿瘤细胞,对正常组织影响较小,此技术为肿瘤的靶向定位开辟了一条新的途径。目前国内外分别开展了一些研究。L u b b e(1996)实施了人造磁粒对大鼠的急性毒性试验,认为人造磁性颗粒的加入不会影响磁物制剂的急性毒性,器