(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010509214.7
(22)申请日 2020.06.07
(71)申请人 上海佰臻生物科技有限公司
地址 201206 上海市浦东新区自由贸易试
验区锦绣东路2777弄35号1202室
(72)发明人 陆军
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)
C12Q 1/6886(2018.01)
C12Q 1/6883(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物(57)摘要本发明公开了一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物，包括以下步骤：准备基因组DNA材料，浓度在20ng/ul以上，A260/280比值在1.8-2.0之间，确定MTHFR引物及探针；使用MTHFR的引物和探针对基因组DNA进行PCR反应；PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型。本发明能高通量检测其SNP 位点，结果容易判读，每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易，可对人MTHFR基因SNP位点实现高通量检测，在对人进行MTHFR基因检测中具有
广阔的应用价值。权利要求书1页 说明书3页CN 111621554 A 2020.09.04
C N 111621554
A
1.一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物，其特征在于，包括以下步骤：
（1）准备基因组DNA材料，浓度在20ng/ul以上，A260/280比值在1.8-2.0之间，确定MTHFR引物及探针；
（2）使用MTHFR的引物和探针对基因组DNA进行PCR反应；
（3）PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；
基因分型的具体步骤如下：
通过TaqmanMGB探针法进行基因分型，使用rs1801131位点引物和探针对进行检测；所述基因的引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5'-AGGAGGAGCTGCTGAAGATGT -3'
反向引物：5'-ACCATTCCGGTTTGGTTCT -3'；
所述探针的核苷酸序列如下：
P1-T：5'-FAM -AGTGAAGTAAGTGTC -MGB -3'
P1-C：5'-VIC -AGTGAAGCAAGTGTC -MGB -3'；
引物和探针由生工生物公司合成。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物，其特征在于，上述合成的引物和探针在荧光定量PCR系统中，以提取的基因组DNA为模板，进行扩增(10μL反应体系)，具体实施步骤：
（1）考虑到移液器及吸头的误差，一般每个96孔板按105个反应计算体系，配制好mix；
（2）每个96孔板设置一个空白对照NTC，设置两个已知TT型MTHFR基因组对照，一个已知CC型MTHFR基因组对照，一个已知TC型MTHFR基因组对照；
（3）应用排在每孔中加1μLDNA样品；
（4）完成后用封口膜封口，平板离心机离心；
（5）开启ABIQ7实时荧光定量PCR系统，设置参数，反应条件如下：
95℃15min，95℃20sec，60℃1min，40个循环，72℃5min，其中60℃时读荧光。
权 利 要 求 书1/1页CN 111621554 A
一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物
技术领域
[0001]本发明涉及MTHFR基因检测领域，特别涉及一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物。
背景技术
[0002]叶酸是体内极为重要的甲基供体，参与DNA合成和修复，维持细胞内正常甲基化和基因组稳定性。参与叶酸代谢的酶主要有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenet e t r a h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e，M T H F R)、甲硫氨酸合成酶还原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferasereductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase，MTR)、等。叶酸代谢途径中某些酶基因位点变异可能会影响循环中叶酸水平。叶酸代谢酶相关基因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症。一方面，MTHFR催化5,10-亚甲基四氢叶酸生成的5-甲基四氢叶酸的甲基基团生成甲硫氨酸，然后甲硫氨酸在腺苷转移酶的作用下转变成S-腺苷甲硫氨酸，而S-腺苷甲硫氨酸是体内通用的甲基供体。另一方面，MTHFR催化反应的底物5,10-亚甲基四氢叶酸与胸腺嘧啶和嘌呤合成等多个代谢通路有关，对于DNA合成有着极其重要的作用。
[0003]叶酸代谢酶的突变会直接导致DNA合成和修复产生障碍、细胞内甲基化异常以及基因组的不稳定，成为肿瘤发生和发展的一个重要原因，也是相关肿瘤用药(如5-FU)的重要依据。同时，叶酸代谢酶的多态性也影响孕妇对叶酸的吸收，相关基因的检测能有效降低新生儿出生缺陷风险，降低母体患孕妇巨红细胞性贫血、心脑血管疾病、恶性肿瘤、妊娠高血压、先兆子痫等妊娠期并发症的风险，并预防胎儿产生胚胎神经管畸形、唇腭裂、先天性心脏畸形等疾病。
[0004]研究证实，与甲基类维生素(叶酸及维生素B12)代谢密切相关的基因主要有MTHFR、MTHFR和M
TR等，其中MTHFR在叶酸代谢过程中起着更为关键的作用。MTHFR基因位于人类一号染体1p36.3上，基因组全长15.8kb，包括11个外显子和10个内含子，整个编码区长1980bp。MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，能将5,10-MTHF转变成5-MTHF，从而参与蛋氨酸代谢循环和DNA的甲基化。
发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一组用于人MTHFR基因SNP 检测的引物组，它可以用于快速、准确、灵敏地检测人MTHFR基因的多态性。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物，包括以下步骤：（1）准备基因组DNA材料，浓度在20ng/ul以上，A260/280比值在1.8-2.0之间，确定MTHFR引物及探针；
（2）使用MTHFR的引物和探针对基因组DNA进行PCR反应；
（3）PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；
基因分型的具体步骤如下：
通过TaqmanMGB探针法进行基因分型，使用rs1801131位点引物和探针对进行检测；
所述基因的引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5'-AGGAGGAGCTGCTGAAGATGT-3'
反向引物：5'-ACCATTCCGGTTTGGTTCT-3'；
所述探针的核苷酸序列如下：
P1-T：5'-FAM-AGTGAAGTAAGTGTC-MGB-3'
P1-C：5'-VIC-AGTGAAGCAAGTGTC-MGB-3'；
引物和探针由生工生物公司合成。
[0007]作为本发明的一种优选技术方案，上述合成的引物和探针在荧光定量PCR系统中，以提取的基因组DNA为模板，进行扩增(10μL反应体系)，具体实施步骤如下：（1）考虑到移液器及吸头的误差，一般每个96孔板按105个反应计算体系，配制好mix；
（2）每个96孔板设置一个空白对照NTC，设置两个已知TT型MTHFR基因组对照，一个已知CC型MTHFR基因组对照，一个已知TC型MTHFR基因组对照；
（3）应用排在每孔中加1μLDNA样品；
（4）完成后用封口膜封口，平板离心机离心；
（5）开启ABIQ7实时荧光定量PCR系统，设置参数，反应条件如下：
95℃15min，95℃20sec，60℃1min，40个循环，72℃5min，其中60℃时读荧光。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的利用TaqmanMGB探针检测人MTHFR基因多态性的方法，能高通量检测其SNP位点，结果容易判读。每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易，可对人MTHFR基因SNP位点实现高通量检测，在对人进行MTHFR基因检测中具有广阔的应用价值。
具体实施方式
[0009]以下结合实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0010]实施例1
本发明提供一种基于荧光定量PCR检测人MTHFR基因多态性的方法及引物，包括以下步骤：
（1）准备基因组DNA材料，浓度在20ng/ul以上，A260/280比值在1.8-2.0之间，确定MTHFR引物及探针；
（2）使用MTHFR的引物和探针对基因组DNA进行PCR反应；
（3）PCR结束后进行荧光读取，并进行基因分型；
基因分型的具体步骤如下：
通过TaqmanMGB探针法进行基因分型，使用rs1801131位点引物和探针对进行检测；
所述基因的引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5'-AGGAGGAGCTGCTGAAGATGT-3'
反向引物：5'-ACCATTCCGGTTTGGTTCT-3'；
所述探针的核苷酸序列如下：
P1-T：5'-FAM-AGTGAAGTAAGTGTC-MGB-3'
P1-C：5'-VIC-AGTGAAGCAAGTGTC-MGB-3'；
引物和探针由生工生物公司合成。
[0011]上述合成的引物和探针在荧光定量PCR系统中，以提取的基因组DNA为模板，进行扩增(10μL反应体系)，具体实施步骤如下：
（1）考虑到移液器及吸头的误差，一般每个96孔板按105个反应计算体系，配制好mix；
（2）每个96孔板设置一个空白对照NTC，设置两个已知TT型MTHFR基因组对照，一个已知CC型MTHFR基因组对照，一个已知TC型MTHFR基因组对照；
（3）应用排在每孔中加1μLDNA样品；
（4）完成后用封口膜封口，平板离心机离心；
（5）开启ABIQ7实时荧光定量PCR系统，设置参数，反应条件如下：
95℃15min，95℃20sec，60℃1min，40个循环，72℃5min，其中60℃时读荧光。
[0012]具体的，Taqman探针PCR反应体系中含有一对双标记的探针和一对PCR引物，用两种荧光染料Fam，Hex(Vic)分别标记这两种探针，TaqMan探针上有一个荧光发光基团(reporterdye简称R基团)和一个荧光猝灭基团(quencher简称Q基团)，完整的探针上的这两个基团靠的很近，R基团发出的荧光在Q基团的吸收波长范围内，则会被Q基团吸收，因此不会产生荧光，当探针与模板结合，上游引物(5’端的)延伸到探针结合的地方时，利用聚合酶(Taqpolymerase)的5’-3’的外切酶活性把探针降解，同时把R基团从探针上游离下来，使它和猝灭集团分开，这时就会产生荧光，最后通过终点读板检测信号来确定是否存在SNP位点。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的利用TaqmanMGB探针检测人MTHFR基因多态性的方法，能高通量检测其SNP位点，结果容易判读。每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易，可对人MTHFR基因SNP位点实现高通量检测，在对人进行MTHFR基因检测中具有广阔的应用价值。
[0014]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的
技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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