[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1824305A [43]公开日2006年8月30日
[21]申请号200510135193.2[22]申请日2005.12.29
[21]申请号200510135193.2
[71]申请人中国人民解放军第三军医大学第三
附属医院
地址400042重庆市渝中区大坪长江支路10号
[72]发明人吕凤林 何萍 胡承香 何凤慈 [74]专利代理机构北京华科联合专利事务所代理人王为 涂荣昌
[51]Int.CI.A61K 39/39 (2006.01)A61P 31/12 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页
[54]发明名称
及用途
[57]摘要
一种可以提高疫苗效果的纳米铝佐剂的制备方
法及用途，其基本特征在于它的颗粒直径为1－999
纳米，成分为氢氧化铝化合物。颗粒直径为1－999
纳米的氢氧化铝化合物具有分散性好、不含杂质、
能够吸附更多的疫苗成分等优点，所用设备、工艺
简单，具有良好的发展前途，纳米氢氧化铝化合物
佐剂适用于由病毒或类病毒成分(蛋白、DNA、RNA)
所制备的物质，或将病毒(或类病毒)经灭活、减毒、
弱毒等处理后所制备的物质。
200510135193.2权 利 要 求 书第1/1页
1.一种可提高疫苗效果的纳米铝佐剂，其特征在于，它的颗粒直径为1-999纳米，成分为氢氧化铝。
2、权利要求1的纳米铝佐剂，其特征在于，它的颗粒直径为1-400纳米。
3、如权利要求1所述的纳米铝佐剂，其特征在于，它的颗粒直径为1-100纳米。
4、如权利要求1所述的纳米铝佐剂，其特征在于，它的颗粒直径为为平均粒经
72纳米。
5、如权利要求1所述的纳米铝佐剂，在制备疫苗中的应用。
6、权利要求5的应用，所述疫苗为任何一种人用或动物用疫苗。
7、权利要求6的应用，所述疫苗选自乙肝疫苗、狂犬疫苗、禽流感疫苗、SARS
疫苗、人流感疫苗、人腮腺炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗。
8、如权利要求1所述的纳米铝佐剂的制备方法，其特征在于，其中所述纳米铝
佐剂的制备包括以下步骤：
取AlCl3、环己烷和蒸馏水于烧杯中，再加入中性离子保护剂、助表面活
性剂，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。倒入有盖的
反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水，盖上盖子，反应3小时，即
为Al(OH)3溶胶，采用冷冻干燥法或真空干燥法，得到。
9、如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述助表面活性剂为混合表面
活性剂，由苯扎溴铵与正辛醇混合，质量比以1∶4；1∶3；1∶2；8∶5；1∶1；2∶1；3∶1；4∶1的配
比，其中混合表面活性剂与环己烷按照质量比为1∶9、1∶4、1∶3、4∶1、9∶1、3∶1、5∶0；氨水的使用剂量为1-50毫升，添加氨水的
滴速10-50滴每分钟，保持体系的pH值在8以上，反应时间为0.5-5小时，使
用的水为实验室用途的纯净水，乙醇浓度为75-100％。
10、如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述助表面活性剂为混合表
面活性剂，由苯扎溴铵与正辛醇混合，质量比为1∶1；其中混合表面活性剂与
环己烷按照质量比为1∶9、1∶4、1∶3、4∶1、9∶1、3∶1、5∶0；氨水的使
用剂量为10毫升，添加氨水的滴速为30滴每分钟，保持体系的pH值为10，反
应时间为2小时；使用的水为去离子水；乙醇浓度95％；丙酮使用分析纯，浓度
为1.0摩尔每升。
200510135193.2说 明 书第1/6页一种可以提高疫苗效果的纳米铝佐剂的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种人用疫苗纳米铝佐剂及其制备方法，以及含有纳米铝佐剂的疫苗组合物及其制备方法。
技术背景
疫苗通常主要通过以下方法方法：在细胞中接种病毒毒种；收获病毒液；病毒液的灭活；澄清超滤；纯化；稀释分装。其中多数疫苗需要加入铝佐剂。主要起吸附作用。
铝佐剂吸附抗原的主要机制包括：静电力、疏水作用以及基团交换[V o g e l F R，H e m S L.I n：P l o t k i n S A，O r e n s t e i n M D，e d i t o r s.V a c c i n e s.4t h e d.N e w Y o r k：S a n d e r s]。磷酸根与铝在共价键的无机等价交换作用下，形成了内球表面。磷酸根对铝原子的连接比氢氧根更强，从而代替了氢氧根离子[H i n g s t o n F J，A t k i n s o n RJ，Quirk JP.Specific adsorption of anions.Nature(London).1967，215：1459-1461.和Liu J，Fe ldk amp JL，W hit e J L，et al.Ads orp tio n of ph osp hat e by al umi num hydroxycarbonate.J Pharm Sci.1984，73：1355-1358.]。
目前商业用的铝佐剂主要为氢氧化铝和磷酸铝，但通常所指的铝佐剂主要是氢氧化铝，它实际上是A l(O H)3(a l u m i n u m h y d r o x i d e)分子内脱水的纤维状结晶态产物偏氢氧化铝(aluminum oxyhydroxide)，分子式为AlOOH。
目前公认丹麦产的A l h y d r o g e l为标准，其胶粒大小为3.07微米。铝佐剂的等电点p I(i s o e l e c t r i c p o i n t)＝11.4，在机体p H＝7.4的间质液中带正电荷，能很好的吸附酸性蛋白抗原的特点：
①使用时间长：从1926年开始使用；②安全有效；③价廉；④广泛应用；
⑤对某些疫苗辅佐效果弱或无佐剂活性；⑥易诱导I g E的表达；⑦注射部位偶有出现红斑、皮下结节、接触性过敏反应和肉芽肿性炎症等，甚至有的还出现比较严重的局部反应。
如果将铝佐剂制备成纳米级颗粒，由于比表面积急剧增大，具有表面反应活性高、表面活性中心多、吸附能力强等这些优异性质，从而可能吸附更多的抗原，而且还能够产生爆释效应，铝佐剂的粒径是影响铝佐剂吸附度的主要因素。德国
科学家K r e u t e r e t a l(1982年)首次将纳米技术应用于疫苗佐剂，他们用流感病毒抗原与纳米多聚甲基丙烯酸酯(P L C)聚合后免疫小鼠，发现该疫苗可以保护小鼠免受鼠流感病毒的侵袭。而且，该疫苗比一般佐剂和未使用佐剂的疫苗对温度变化更稳定。而我们对纳米铝佐剂的体液免疫应答的研究结果，其机制可能是由于纳米颗粒的粒径小，不仅可以吸附更多的抗原蛋白，而且也易于被抗原呈递细胞(A P C细胞)摄取，即初次免疫后的爆释效应(b u r s t-r e l e a s e d)，R a g h u v a n s h i 等[Raghuvanshi RS，Katare YK，Komal Lalwani，et al.Improved immune response from biodegradable polymer particles entraiepepng tetanus toxoid by use of different immunization protocol and adjuvants.International Journal of Pharmaceutics. 2002，245：109-121]也观察到该爆释效应，他们制备了纳米P L G A佐剂(P o l y l a c t i d e-c o-g l y c o l i d e)包载破伤风类毒素，与其微米粒子物理混合
后，免疫小鼠发现：抗体滴度形成两个波峰。在纳米粒子的快速爆释(b u r s t-r e l e a s e d)抗原后，快速呈递给M H C-I I类分子，从而获得了较早的抗体应答[M e n Y，A u d r a n R，Thomasin C，et al.MHC class Iand class II-restricted processing and presentation of microencapsulated antigens.Vaccine.1999；17：1047-1056]。爆释效应是“抗原储存库”效应的快速释放。
发明内容
本发明提供一种新型人用疫苗佐剂，其特征是，为纳米铝佐剂材料，
纳米铝佐剂可使市售的人用疫苗更多地被纳米铝佐剂所吸附，效果优于
常规铝佐剂所吸附的传统的人用疫苗。
本发明的纳米铝佐剂制成的人用疫苗可以在第一次免疫接种之后快速地产生应答，适合于紧急预防接种。新型人用疫苗还大大降低了副作用，注射疫苗部位的炎症性结节明显减少甚至根本没有。
本发明是通过以下技术方案实现的，将氢氧化铝原料制成颗粒直径为
1-999纳米的纳米级微粒、此氢氧化铝微粒即本发明的纳米铝佐剂，可作为疫苗配方中铝佐剂的原料，优选的氢氧化铝颗粒粒度为1-400纳米，更优选的为1-100纳米，最优选的为72纳米。
本发明通过电子显微镜观察测量的方法对氢氧化铝纳米粒进行粒度测定，以得到合格的质量稳定的纳米级氢氧化铝。
测定方法见本发明实施例。
本发明的纳米铝佐剂，可以采用化学法和机械法两种方法制备。化学法能够制得纳米级的粉体。机械粉碎法成本低、产量大，是制备超微粉体的主要手段，现已大规模应用于工业生产。超微粉碎可分为干法粉碎和湿法粉碎：根据粉碎过程中产生粉碎力的原理不同，干法粉碎有气流式、高频振动式、旋转球(棒)磨式、锤击式和自磨式等几种形式；湿法粉碎主要是胶体磨和均质机。本发明可以通过以上任意的方法得到粒径在1-999纳米的铝佐剂产品，优选使用化学法。 如以下方法： 取一定量的AlCl3、环己烷和蒸馏水于烧杯中，再加入中性离子保护
剂、助表面活性剂，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。
倒入有盖的反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水，盖上盖子，反应3
小时，即为Al(OH)3溶胶，采用冷冻干燥法或真空干燥法，得到干粉。
其中助表面活性剂为混合表面活性剂，由苯扎溴铵与正辛醇混合，质量比以1∶4；1∶3；1∶2；8∶5；1
∶1；2∶1；3∶1；4∶1的配比，最佳配比为1∶1。其中混合表面活性剂与环己烷按照质量比为1∶9、1∶4、1∶3、4∶1、9∶1、3∶1、5∶0。氨水的使用剂量为1-50毫升，推荐剂量为10毫升，添加氨水的滴速约10-50滴每分钟，推荐滴速约30滴每分钟，保持体系的p H值在8以上，推荐p H值为10，反应时间为0.5-5小时，最佳时间为2小时；使用的水为实验室用途的纯净水，推荐使用去离子水；乙醇浓度为75-100％，推荐浓度为95％；反应体系中加入丙酮的目的是破乳，使用浓度为1.0摩尔每升，推荐使用分析纯。 本发明优选的方法列在本发明实施例中。
本发明适用于各种疫苗，这里所指的疫苗，是以病毒或类病毒的蛋白、D N A、R N A成分或全病毒为抗原，能够使机体产生针对该抗原的免疫应答的物质。如乙肝疫苗、狂犬疫苗、禽流感疫苗、S A R S疫苗、人流感疫苗、人腮腺炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗等
采用本发明的纳米铝佐剂材料制备的人用狂犬疫苗，形成新型的人用狂犬疫苗。新型的人用狂犬疫苗在具备了常规狂犬疫苗优点的基础上，还能够快速激活机体的免疫应答，造成注射部位的炎性反应明显减小，甚至根本没有炎性反应。 采用本发明的纳米铝佐剂材料制备的人用乙肝疫苗，形成新型的人用乙肝疫
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