[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101200750A [43]公开日2008年6月18日
[21]申请号200710190755.2[22]申请日2007.11.29
[21]申请号200710190755.2
[71]申请人南京工业大学
地址210009江苏省南京市新模范马路5号
[72]发明人徐虹 李莎 环民霞 林璐 蔡恒 欧阳平
凯 [74]专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司代理人徐冬涛
[51]Int.CI.C12P 19/12 (2006.01)C12R 1/18 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页
[54]发明名称
一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应
用
[57]摘要
本发明公开一种大黄欧文氏菌(Erwiniarhapon
tici)NX－5及利用该菌生产蔗糖异构酶进而制备异 麦芽酮糖的方法。将该菌株CGMCC No.2222接种于
成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化
蔗糖生成异麦芽酮糖。采用该菌株使蔗糖转化率高
达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率达90％，转化
液中异麦芽酮糖浓度达500g/L，无水解副反应，转
化液中几乎不含葡萄糖和果糖，随着反应进行也不
会使产物异麦芽酮糖转化为其他成分，对工业化生
产异麦芽酮糖十分有益。
200710190755.2权 利 要 求 书第1/1页 1.一种大黄欧文氏菌NX-5，其分类命名为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)NX-5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC No.2222。
2.权利要求1所述的大黄欧文氏菌在生产异麦芽酮糖中的应用。3、根据权利要求2所述的应用，其特征
在于该应用的具体方法为将该菌株CGMCC No.2222接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述培养基中，各组分用量为：碳源用量为2～10g/100ml，氮源用量为0.2～5g/100ml，无机盐用量为0.01～1g/100ml，其余为水。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将菌株CGMCC No.2222进行培养的条件是：培养基初始p H为6.0～8.0，培养温度为25～35℃，培养时间为8～20h。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于采用离心或超滤的方法获得含蔗糖异构酶细胞，所用超滤膜孔径0.01-0.1μm，操作压力0.1-0.6Mpa，超滤膜截流分子量为105～106道尔顿。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生产异麦芽酮糖是将游离细胞或固定化后的细胞填充至反应罐中，加入450～600g/L的蔗糖溶液；或者将固定化细胞装入填充床式
柱反应器中，该反应器以0.5～5ml/min的流速单向流加或循环连续流加450～600g/L的蔗糖溶液，进行酶转化反应，反应温度25～35℃，每批转化时间8～15h。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于固定化细胞是采用海藻酸钙、卡拉胶或甲壳素作为固定化载体。
200710190755.2说 明 书第1/6页一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用
技术领域
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，涉及一种产蔗糖异构酶的微生物菌株大黄欧文氏菌(E r w i n i a r h a p o n t i c i)N X-5，以及将它用于异麦芽酮糖的生产。 背景技术
异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose)是一种还原性糖，在天然蜂蜜和甜菜汁中少量存在，具有与蔗糖最为类似的物理性质和口感。作为蔗糖的替代品它具有如下优点：(1)由于它被人体食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰岛素分泌，可供糖尿病人和减肥人士食用；(2)不被导致龋齿的口腔链球菌代谢，不腐蚀牙齿；(3)在人肠的微生物区中，选择性刺激双歧杆菌的生长；(4)性能食用安全性高，被美国FDA给予食品安全最高等级“GRAS(公认安全)”，对其每日摄入量不作限制，不会令人产生腹胀、肠鸣等不良反应。(5)拥有极低的吸湿性，用它做的硬糖不会像用普通的
糖或其他糖替代品一样变粘，甚至可以被松散地包装。因为吸湿性小，所以稳定性强，货架期也更长。这是木糖醇和麦芽糖醇等功能糖醇难实现的。(6)异麦芽酮糖醇被市场认可的另一主要优点是口味纯正，它几乎可以代替蔗糖的任何用途，消费者分辨不出与有糖食品的区别，使无糖食品“美味不打折”。由于这些特点，异麦芽酮糖(醇)成为目前最受欢迎的蔗糖替代品。
异麦芽酮糖由蔗糖异构酶EC 5.4.99.11(Sucrose isomerase)，或叫异麦芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基变位酶(Sucrose glucosylmutase)，α-葡糖基转移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖转变而成，已知有一些菌种能产生该酶。美国专利4,359,531采用大黄欧文氏菌转化蔗糖，大约70-95％的蔗糖转变成异麦芽酮糖。美国专利4,390,627描述了从Protaminobacter rubrum(红精朊杆菌)固定蔗糖变位酶生产异麦芽酮糖的方法。美国专利4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici，Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica(粘质沙雷氏菌)的固定化菌体生产异麦芽酮糖的过程，大约可以转化70-95％蔗糖。美国专利4,857,461公开了从Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶连续生产异麦
芽酮糖的过程。美国专利N o.5,229,276和N o.5,336,617描述了用A g r o b a c t e r i u m radiobacter(放射性土壤杆菌)的固定化菌体生产海藻酮糖和异麦芽酮糖的过程，异麦芽酮糖占10％以下。虽然上述几种细菌能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率为8～86％。而且，这些生产异麦芽酮糖的菌株在催化蔗糖转化过程中，除了主产物外，酶转化液中还存在海藻酮糖、异麦
芽糖、异松三糖及由于蔗糖水解而生成的葡萄糖、果糖副产物，产物特异性不高，一方面降低了目的产物的收率，另一方面使下游过程变得十分困难，生产成本大大增加。我们对不同来源的异麦芽酮糖生产菌进行对比分析。发现大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222转化所生成的副产物少，更利于进一步工业化生产，如表1所示。
近来专利C N1434861涉及两个新菌株，新加坡克雷伯氏菌(K l e b s i e l l a singaporensis)LX3及LX21，有较高的酶活，异麦芽酮糖的含量超过87％，公开了新型蔗糖异构酶的核苷酸序列以及该基因克隆表达于甘蔗、玉米、甜菜等植物使其生成异麦芽酮糖。筛选能够高效生产异麦芽酮糖的菌株，进一步理解酶的催化作用机制仍是十分有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产蔗糖异构酶的大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)。 本发明的另一个目的是提供利用上述大黄欧文氏菌制备异麦芽酮糖的方法。 本发明目的可以通过下列措施来达到：
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)NX-5，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCC No.2222，保藏日期是：2007年10月22日。以此菌作为生产菌株。 CGMCC No.2222菌株具有下述性质：
(1)菌落形态学特征：
在营养琼脂上，30℃培养24h出现淡黄小菌落，菌落呈圆形，表面光滑，粘状，中央凸起，不透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。
(2)生理与生化特性：
a.培养温度：25～35℃，最适温度为30℃；
b.在pH 5～8范围内生长；
c.素产生：产黄素；
d.耐NaCl浓度：在5％浓度可以生长。
(3)营养特征：
大黄欧文氏菌NX-5的培养基中不需要添加生长因子。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。
本发明利用大黄欧文氏菌CGMCC No.2222生产蔗糖异构酶进而生成异麦芽酮糖的方法是将该菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好气培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，
进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。
产酶条件：
将大黄欧文氏菌NX-5 CGMCC No.2222斜面活化一天后(斜面培养基成分除含有碳源、氮源、无机盐等之外，还含有2％的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中。培养基中各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml培养基，以下同。碳源用量与培养基之比2～10g/100ml，氮源用量与培养基之比0.2～5g/100ml，无机盐用量与培养基之比0.01～1g/100ml，其余为水。培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐中的一种或多种。培养基的初始pH范围为6.0～8.0，发酵温度25～35℃，摇床转速100～200r/min，培养8～20h，细胞湿重达20g/L，发酵液酶活达2.5～5.0U/ml，然后离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，离心条件：室温条件下，5000～10000r/min，10～30min。采用超滤法所用超滤膜孔径0.01～0.1μm，操作压力0.1～0.6Mpa，超滤膜截流分子量为105～106道尔顿。
蔗糖异构酶酶活测定方法：
用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)配制含40％(w/v)蔗糖和75g/L细胞悬浮液的混合物，取该混合物1ml于3
0℃的水浴内反应60min后，置于100℃的沸水中10min以终止酶反应，然后用自来水冷却至室温。反应混合物经过离心和过滤后用HPLC法测定异麦芽酮糖生成量。一个单位的蔗糖异构酶酶活定义为在30℃下，pH为7.0的条件下每分钟生成1μmol的异麦芽酮糖的酶量。
酶法转化：
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