(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210729012.2
(22)申请日 2022.06.24
(71)申请人 浙江工业大学
地址 310014 浙江省杭州市拱墅区潮王路
18号
申请人 浙江英沃迪生物科技有限公司
(72)发明人 杨杜霞 刘训 于欣君 乔菁菁 张飞龙 肖延铭 应向贤 章银军
(74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公
司 33201
专利代理师 黄美娟 李世玉
(51)Int.Cl.
C12N 9/18(2006.01)
C12N 15/55(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)C12P 41/00(2006.01)C12P 7/02(2006.01)C07C 35/12(2006.01)C07C 29/74(2006.01)C07C 29/76(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
的应用
(57)摘要
本发明公开了一种酯酶pnbA ‑BS突变体及其
在制备l ‑薄荷醇中的应用，所述酯酶pnbA ‑BS突
变体是以SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位
丙氨酸突变为脯氨酸获得。以表达酯酶pnbA ‑BS
突变体A400P的基因工程菌为整细胞催化剂，催
化dl ‑乙酸薄荷酯的选择性拆分，恒速流加方式
加入底物，底物加入量可达1700mM，产物l ‑薄荷 醇e.e.值>99％，产物累积浓度可达600mM，反应 时空得率可达160g/(L ·d)。反应体系不添加有
机溶剂，减少了化学品的使用，简化了产物分离
工艺，是一种绿、高效、简便的新型l ‑薄荷醇制
备方法。权利要求书2页 说明书14页序列表6页 附图8页CN 115109765 A 2022.09.27
C N 115109765
A
1.一种酯酶pnbA‑BS突变体，其特征在于，所述酯酶pnbA‑BS突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突变为脯氨酸获得的。
2.一种含权利要求1所述酯酶pnbA‑BS突变体的编码基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将酯酶pnbA‑BS突变体编码基因插入pET28a载体上的Nco I和Xho I位点，得到重组载体pET28a‑pnbA‑B
S‑A400P。
3.一种权利要求2所述重组载体构建的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌是将所述重组载体导入宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中获得的。
4.一种权利要求1所述酯酶pnbA‑BS突变体在催化dl‑乙酸薄荷酯制备l‑薄荷醇中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将含酯酶pnbA‑BS突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体制得的冻干菌体或湿菌体经超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以dl‑乙酸薄荷酯为底物，以pH 5.0～9.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构成反应体系，在10～50℃、600rpm条件下转化反应8～24h，获得含l‑薄荷醇的反应液，反应液经离心去除菌体并收集有机相，有机相经分离纯化，获得l‑薄荷醇。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂为纯酶液时用量以蛋白含量计为1～5g/L，催化剂为冻干菌体时用量为10～30g/L，催化剂为湿菌体时用量为30～80g/L；底物加入量为100～1700mM。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体和冻干菌体按如下方法制备：将含酯酶pnbA‑BS突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那
为0.5～0.7，再加入终浓度为0.5mM的IPTG，24℃霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD
600
诱导16h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；湿菌体经真空冷冻干燥24h，获得冻干菌体。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述纯酶液按如下方法制备：(1)将湿菌体以1g：20mL的比例加入pH 8.1、50mM的Tris‑HCl缓冲液中，在125W、工作2s、间隔6s的条件下超声破碎15min，离心，取上清即为粗酶液；(2)取粗酶液加至DEAE离子交换柱中，手动上样，用Buffer A平衡后，依次用体积比9:1，4:1，3:1以及1:1的Buffer A和Buffer B的混合液作为洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速率3.0mL/min，每个洗脱液洗脱1.5个柱体积，收集体积比4:1的洗脱液对应的流出液，流出液用截留分子量为10kDa超滤管浓缩脱盐，收集截留液；(3)将步骤(2)截留液上样于凝胶过滤层析柱，填料为丙烯葡聚糖凝胶S‑200，用50mM，pH 8.1的Tris‑HCl缓冲液作为洗脱液；洗脱速率为0.5mL/min，控制压力在0.42～0.47Mpa间保持稳定；收集具有酯酶活力的流出液并用截留分子量为10kDa的超滤管进行浓缩，取截留液即得到酯酶pnbA‑BS突变体纯酶液；所述Buffer A：50mM的Tris‑HCl缓冲液，pH 8.1；所述Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris‑HCl缓冲液，pH 8.1。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于在反应过程中底物一次加入或者恒速流加方式加入；当底物加
载量小于1000mM时，在反应开始时一次加入，反应时间8～14h；当底物加载量为1000～1700mM，底物按恒速流加方式进行：初始底物浓度为250mM，剩余底物通过恒速微量泵注入到反应体系中，恒速流加时间为10h，底物流加完成后再继续反应4～14h。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化方法为：所得反应液在
12000rpm下离心10min去除菌体，取上层有机相加适量无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min；取上层有机相经有机膜过滤去除菌体蛋白；滤液进行硅胶柱层析，填料为300目硅胶，湿法上样，流动相为体积比1:20的乙酸乙酯：正己烷，流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积，收集l‑薄荷醇洗脱峰，用减压蒸馏除去溶剂，到产物l‑薄荷醇。
酯酶pnbA‑BS突变体及其在制备l‑薄荷醇中的应用
(一)技术领域
[0001]本发明属于生物催化领域，涉及酯酶pnbA‑BS突变体及其在生物酶法选择性拆分制备光学纯l‑薄荷醇中的应用。
(二)背景技术
[0002]薄荷醇是世界三大香料之一，是环状单菇烯醇中需求量最大的香料，为薄荷和薄荷精油中的主要成分。因其分子存在3个手性中心，所以它有4对8种对映异构体，分别为dl‑薄荷醇、dl‑异薄荷醇、dl‑新薄荷醇和dl‑新异薄荷醇。8种异构体中，只有l‑薄荷醇具有特征的薄荷香气和强烈的清凉作用，气味新鲜轻快，具有兴奋镇痛、杀菌止痒、促渗透、助消化等功效，在食品、日用化工、饮料、医药等领域具有广泛应用。
[0003]德之馨公司以间甲酚为原料开发了薄荷醇生成工艺。在路易斯酸催化条件下，间甲酚和丙烯反应生成百里酚，百里酚再经加氢还原得到含有8中异构体的薄荷醇混合物。后续通过精馏得到dl‑薄荷醇，再经酯化dl‑薄荷醇酯。dl‑薄荷醇酯通过选择性拆分得到l‑薄荷醇。与化学法拆分相比，生物酶法拆分具有条件温和、绿环保等优点，为产业界所青睐。然而，由于缺乏同时满足高活力和高对映体选择性的专用酶，目前生物酶法还达不到实际应用的要求。
[0004]为了提高酯酶的l‑对映体选择性及其催化制备l‑薄荷醇的效率，对源自Bacillus subtilis 168的酯酶pnbA‑BS进行分子改造，获得了在选择性拆分dl‑乙酸薄荷酯中具有严格l‑对映体选择性的突变体。该酯酶pnbA‑BS突变体在大肠杆菌中表达，获得基因工程菌。以该基因工程菌为催化剂，反应体系不添加有机溶剂，同时采取底物流加方式减轻底物抑制，建立了一种高效、绿、简便的l‑薄荷醇制备方法。该方法底物加载量可达1700mM，产物浓度可达600mM，产物e.e.值>99％，时空产率可达160.52g/(L·d)。
(三)发明内容
[0005]本发明目的是提供一种具有严格l‑薄荷醇对映体选择性的酯酶pnbA‑BS突变体及其在制备l‑薄荷醇中的应用。通过对酯酶pnbA‑BS的半理性设计，获得了酯酶突变体pnbA‑BS‑A400P，该突变体在选择性拆分dl‑乙酸薄荷酯中具有严格的l‑对映体选择性。以表达酯酶突变体pnbA‑BS‑A400P的基因工程菌湿菌体为催化剂，催化dl‑乙酸薄荷酯的选择性拆分，结合底物工程和介质工程，形成了一种绿、高效、简便的新型l‑薄荷醇制备方法，该方法产物光学纯度高，反应体系不添加有机溶剂，并且反应时空得率可达160g/(L·d)。[0006]本发明采用的技术方案是：
[0007]本发明提供一种酯酶pnbA‑BS突变体，所述酯酶pnbA‑BS突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突变为脯氨酸获得的，记为酯酶突变体pnbA‑BS‑A400P，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本发明还提供一种所述酯酶pnbA‑BS突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0009]本发明还涉及一种含所述酯酶pnbA‑BS突变体编码基因的重组载体以及基因工程菌。所述重组载体按如下方法构建：如SEQ ID NO.3所示酯酶pnbA‑BS突变体编码基因插入pET28a载体上的Nco I和Xho I位点，得到重组载体pET28a‑pnbA‑BS‑A400P。所述基因工程菌按如下方法构建：将重组载体
pET28a‑pnbA‑BS‑A400P导入重组菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)//pET28a‑pnbA‑BS‑A400P。
[0010]此外，本发明还提供一种酯酶pnbA‑BS突变体在催化dl‑乙酸薄荷酯制备l‑薄荷醇中的应用，所述应用为：将含酯酶pnbA‑BS突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体制得的冻干菌体或湿菌体经超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以dl‑乙酸薄荷酯为底物，以pH 5.0～9.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构成反应体系，在10～50℃、600rpm条件下转化反应8～24h，获得含l‑薄荷醇的反应液，反应液经离心去除菌体并收集有机相，有机相经分离纯化，获得l‑薄荷醇。所述反应体系中，催化剂为纯酶液时用量以蛋白含量计为1～5g/L(优选3.5g/L)，催化剂为冻干菌体时用量为10～30g/L(优选20g/L)，催化剂为湿菌体时用量为30～80g/L(优选50g/L)。底物加入量为100～1700mM，优选1300mM。[0011]进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含酯酶pnbA‑BS突变体编码基因的工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD
为0.5～0.7，再加入终浓度为0.5mM的IPTG，24℃诱导16h，获得诱导培养液，再将诱导600
培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。湿菌体经真空冷冻干燥24h，获得冻干菌体。
[0012]进一步，所述纯酶液按如下方法制备：(1)将湿菌体以1g：20mL的比例加入pH 8.1、50mM的Tris‑HCl缓冲液中，在125W、工作2s、间隔6s的条件下超声破碎15min，离心，取上清即为粗酶液；(2)取粗酶液加至DEAE离子交换柱(柱内径1.6cm，柱高15cm)中，在手动模式下进行上样，用Buffer A平衡后，依次用体积比9:1，4:1，3:1以及1:1的Buffer A和Buffer B 的混合液作为洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速率3.0mL/min，每个洗脱液洗脱1.5个柱体积，收集体积比4:1的洗脱液对应的流出液，流出液用截留分子量为10kDa超滤管浓缩脱盐，收集截留液；(3)将步骤(2)截留液上样于凝胶过滤层析柱(柱内径1.6cm，柱高60cm，填料为丙烯葡聚糖凝胶S‑200)，用50mM，pH 8.1的Tris‑HCl缓冲液作为洗脱液；洗脱速率为0.5mL/min，控制压力在0.42～0.47Mpa间保持稳定；收集具有酯酶活力的流出液并用截留分子量为10kDa的超滤管进行浓缩，取截留液即得到酯酶pnbA‑BS突变体纯酶液；所述Buffer A：50mM的Tris‑HCl缓冲液，pH 8.1；所述Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris‑HCl 缓冲液，pH 8.1。
[0013]进一步，在反应过程中底物可以是一次加入或者恒速流加方式加入。当底物加载量小于1000mM时，在反应开始时一次加入，反应时间8～14h。当底物加载量为1000～1700mM，底物按恒速流加方式进行：初始底物浓度为250mM，剩余底物通过恒速微量泵注入到反应体系中，恒速流加时间为10h，底物流加完成后再继续反应4～14h。
[0014]进一步，所述反应液分离纯化方法为：所得反应液在12000rpm下离心10min去除菌体，取上层
有机相加适量无水硫酸钠进行除水处理，然后在12000rpm下再离心1min；取上层有机相经有机膜过滤去除菌体蛋白；滤液采用硅胶柱层析法分离有机相中的底物d‑乙酸薄荷酯和l‑乙酸薄荷酯及产物l‑薄荷醇分离，填料为300目硅胶，湿法上样，流动相为乙酸乙
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