(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010762746.1
(22)申请日 2020.08.01
(83)生物保藏信息
CCTCC NO: M 203078 2003.11.17
(71)申请人 武汉真福医药股份有限公司
地址 430206 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新二路388号武汉光谷国际生
物医药企业加速器17号楼1单元5层
(72)发明人 王业富 胡坤坤 董艳山 高雅
高丽
(74)专利代理机构 北京中济纬天专利代理有限
公司 11429
代理人 邓佳
(51)Int.Cl.
A61K 38/48(2006.01)
A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了纳豆激酶在冠心病上的
大鼠的粪便里面脂肪代谢物显著提升，且血液里
面的甘油三酯等显著下降，表明纳豆激酶可有效
改善大鼠的冠心病症状；且与现有冠心病的
药物相比，本发明使用纳豆激酶无毒副作用，使
用更安全。权利要求书1页 说明书4页CN 111840524 A 2020.10.30
C N 111840524
A
1.纳豆激酶在冠心病上的应用。
2.如权利要求1所述的纳豆激酶在冠心病上的应用，其特征在于，所述纳豆激酶由枯草芽孢杆菌发酵产生；所述枯草芽孢杆菌命名为Subtilisin -QK，保藏于国家典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M203078，保藏日期为2002年。
3.如权利要求1所述的纳豆激酶在冠心病上的应用，其特征在于，所述纳豆激酶可与医学上可接受的辅料配合制成液体药剂、胶囊或片剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 111840524 A
纳豆激酶在冠心病上的应用
技术领域
[0001]本发明涉及冠心病技术领域，尤其是，本发明涉及纳豆激酶在冠心病上的应用。
背景技术
[0002]冠心病是心脏的冠状动脉粥样硬化引起心脏供血供氧不足而导致的。其中，冠状动脉是在心脏表面、围绕心脏而为心脏提供血液和营养的血脉通道。人体的生命维持离不开血液通畅流动，而血液循环流动离不开心脏的搏动，心脏的搏动又离不开冠状动脉的营养与支持。冠状动脉粥样硬化则是因为人体的血液在经过冠状动脉营养心脏的时候，由于血液里的胆固醇和脂肪含量高，渐渐形成一种由胆固醇和脂肪等组成的沉淀物，这种沉淀物会使血管通道变窄，这种情况就是冠状动脉粥样硬化。随着冠状动脉粥样硬化越来越严重，血管通道越来越窄，就会导致心肌梗塞，血液无法供养心脏，造成心肌缺血、缺氧或坏死导致的心脏病，即“冠心病”。 [0003]冠心病是全球死亡率最高的疾病之一，根据世界卫生组织的最新报告，中国的冠心病死亡人数已列世界第二位。我国现今患有冠心病的人数是1100万，这个数据还在不断增长。目前随着我国老年化的不断加重，冠心病的发病率和死亡率也呈逐渐上升趋势，已严重威胁着人们的生命安全和健康。据世界卫生组织 (WHO)估计：到2021年左右，我国会迎来心血管疾病(主要为冠心病)的“流行”顶峰。
[0004]常用的冠心病药物有：抗血小板类药物、抗凝类药物、他汀类药物和抗心绞痛类药物(硝酸脂类、β受体阻滞剂)。抗血小板药物有阿司匹林等，其主要功效是抑制血小板在血管内的聚集，防止血小板聚集收缩，从而到达抑制血栓形成的目的。但在临床中发现，此类药物用药个体差异较大，易
造成出血等并发症。抗凝类药物在冠心病的中常用于溶栓的辅助和栓塞高危患者的预防。低分子肝素作为目前临床上常用的抗凝类药物，给药后通过有效的抑制凝血因子Xa的活性，从而发挥较强的抗血栓形成的作用。由于肝素在体内代谢快，半衰期短，血药维持浓度时间短，用药时往往需每日注射。因为冠心病主要是因为患者血中胆固醇含量高导致冠状动脉粥样硬化，他汀类药物主要功效是调脂，可有效提高高密度脂蛋白浓度，降低胆固醇和甘油三脂的水平。但他汀类药物剂量使用较大，且往往需要同其他药物辅助作用效果才显著。抗心绞痛类药物在冠心病的药物中，主要通过扩张冠状动脉、增加心肌供血，降低心肌氧量，从而有效的缓解心绞痛症状。在临床中发现硝酸类药物具有较高的临床耐药性，很多患者在多次给药后出现了耐药性。β受体类阻凝剂药物可通过降低心率、血压和心肌收缩力，减低患者耗氧量，从而减轻心肌缺血、缺氧的发作，但这类药物在临床早期需要严格控制用药量，并且要长期使用，突然停止可导致患者病情加重。
[0005]而冠心病的又是一个漫长而又复杂的过程，其根本原因就在于目前没有一个既安全有效又可以长期服用的药物。
发明内容
[0006]针对现有冠心病药物的缺陷，通过实验发现，在纳豆中分离得一株天然枯草芽孢杆菌，其分泌表达的纳豆激酶对冠心病大鼠具有较好的效果，并且没有观察到常见药物易引起的副作用，即该药物即安全，又效果良好。
[0007]为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供纳豆激酶在冠心病上的应用。
[0008]优选地，所述纳豆激酶由枯草芽孢杆菌发酵产生；所述菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，位于湖北武汉，其保藏编号为CCTCC NO:M 203078，保藏日期为2003年11月17日。
[0009]优选地，所述纳豆激酶可与医学上可接受的辅料配合制成液体药剂、胶囊或片剂。[0010]与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
[0011]本发明通过对冠心病大鼠灌胃纳豆激酶，大鼠的粪便里面脂肪代谢物显著提升，且血液里面的甘油三酯等显著下降，表明纳豆激酶可有效改善大鼠的冠心病症状；且与现有冠心病的药物相比，本发明使用纳豆激酶无毒副作用，使用更安全。
具体实施方式
[0012]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0013]纳豆激酶按以下发酵过程制备。
[0014](1)制备蛋白胨培养基，向培养基中加入以下质量百分比成分：蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸氢二钠1％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.05％、无水氯化钙0.02％、消泡剂0.1％、余量为水，115℃灭菌30min，备用；
[0015](2)将枯草芽孢杆菌按重量比1％接种到蛋白胨培养基中，35℃发酵24h；[0016](3)将发酵液经过除杂、浓缩后喷雾干燥即得纳豆激酶，纳豆激酶活性＞ 80000IU/g。
[0017]本发明实施例以对冠心病大鼠的为例，具体过程如下：
[0018]一、模型的建立
[0019]50只SD大鼠自由饮水进食，饲养于18～22℃的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为五组，每组10只，即正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。正常组以普通饲料喂养，其余各组大鼠每日以高脂饲料喂养含2％胆固醇、10％猪油、0.2％丙基硫氧嘧啶、0.5％胆酸钠、87.3％基础饲料，于末次灌胃前72h开始，每次灌胃30min后，腹腔注射垂体后叶素30U/kg，隔日1次，连续注射3次，建立冠心病心肌缺血模型。正常组予以等容量的生理盐水注射。
[0020]二、实验给药
[0021]大鼠造模成功后，空白组继续正常喂养，给药组中，高剂量组给药量1000IU 活性的纳豆激酶、
中剂量组给药量500IU活性的纳豆激酶、低剂量组给药量250IU 活性的纳豆激酶，将他们都溶解至2ml进行灌胃。正常组和模型组每天灌胃2ml 生理盐水，持续灌胃30天。[0022]三、采集样本和测量
[0023]给药30天后，各组大鼠禁食12h，称重，心脏取血、处死。每组大鼠心脏血中胆固醇含量、甘油三脂、脂肪酶含量如表1、表2所示，表1、表2中数据为各组大鼠的平均值。[0024]脂肪酶活性的测定方法：
[0025]从三油酸甘油酯释放油酸的释放率来判定胰脂肪酶的活性。将三油酸甘油酯 80mg，卵磷脂10mg，牛磺胆酸5mg置于9mL的0.1mol/L的N-三(羟甲基)甲基-3-氨基乙磺酸(TES)，pH7.0并含有0.1mol/L NaC1的缓冲渍中，超声波处理5minn。在超声波处理后的悬浮渍0.1mL中加人0.2mL的血清样品溶液于37℃培养30min。在培养的混合物试管中加人3.0mL 的V氯仿∶V正庚垸＝1∶1，并含有体积分数为2％的甲醇的混合液，混匀并振荡10min进行萃取，然后将混合物离心 (2000r/min)10min，将上清液小心用移液管吸出后.向试管中加入铜试剂，再振荡10min，离心(2000r/min)10min，吸取上层液0.5mL，其中含有铜盐萃取的游离脂肪酸，将此溶液用0.5mL含有0.5g/L羟基苯甲醚的氯仿溶液进行处理，最后在480nm波长下涮定其吸光度值。
[0026]表1
[0027]组别胆固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)对照组 1.618±0.1880.548±0.200
低剂量组 1.901±0.2870.701±0.212
中剂量组 1.652±0.3220.573±0.133
高剂量组 1.605±0.2070.529±0.158
模型组 2.005±0.2670.779±0.224
[0028]从表1看到，与正常组相比，高脂食物和注射激素的冠心病模型组大鼠心脏血液中胆固醇和甘油三酯明显升高。而通过用纳豆激酶之后，发现纳豆激酶的三个剂量组都有效果，并且中剂量组和高剂量组的效果特别明显，在过程中发现，大鼠经过后精神状态和每天的活跃情况得到了明显的改善。解剖大鼠心脏也同样发现了大鼠冠状动脉壁没有看到有粥样硬化现象，而模型组可以看到，明显的粥样硬化，说明冠心病大鼠在通过纳豆激酶之后，可以明显的改善冠心病的症状。
[0029]表2
[0030]组别与对照组脂肪酶活性比对/％
对照组100±1.2
低剂量组58.88±5.8
中剂量组27.5±3.0
高剂量组12.5±0.8
模型组213±10.5
[0031]称取0.2g干燥的粪便样品，加无水乙醇1.75mL，6％Ba(OH)2 0.1mL，10％ ZnSO4 0.05mL，充分摇匀后离心10min(2500r/min)，产生沉淀以除去蛋白质和胆素，吸取上清液于玻璃试管中蒸干，残渣加蒸馏水0.1mL及氯仿-甲醇(2∶1， v/v)混合液3.9mL，充分混匀振摇，静置分层。在上层溶液中含有胆汁酸，下层液中含有胆固醇和磷脂类。大鼠粪便中的胆固醇、甘油三酯和总胆汁酸的含量测定结果如表3所示，表3中数据为各组大鼠的平均值。[0032]表3
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