[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1329672A [43]公开日2002年1月2日
[21]申请号99814175.5[21]申请号99814175.5[22]申请日99.10.5[30]优先权
[32]1998.10.08 [33]DE [31]19846301.4
[86]国际申请PCT/EP99/07394 1999.10.05
[87]国际公布WO00/22162 DE 2000.04.20
[85]进入国家阶段日期2001.06.06
[71]申请人罗赫诊断器材股份有限公司
地址德国曼海姆
[72]发明人R·维谢特 W·特雷贝尔
[74]专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司
代理人罗宏 邰红[51]Int.CI 7C12Q 1/42
权利要求书 1 页 说明书 9 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及到一种用于通过光学测量测定一个
组合的手段消除了游离的血红蛋白或血液代用品的
干扰，本发明还涉及到一种在碱性磷酸酶的测定中
消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰的方法以
及特定波长的组合在消除游离的血红蛋白或血液代
用品的干扰中的使用。
99814175.5权 利 要 求 书第1/1页 1.通过光学测量测定样品中的碱性磷酸酶的方法，其中450±10nm被用作主测波长，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。
2.权利要求1的方法，其中480±10n m被用作次测波长。
3.权利要求1的方法，其中546±10n m被用作次测波长。
4.权利要求1的方法，其中575±10n m被用作次测波长。
5.权利要求1的方法，其中570n m被用作次测波长。
6.前述权利要求之一所要求的方法，其中测定在血清或血浆样品中进行。
7.前述权利要求之一所要求的方法，其中被测定的样品含有游离的血红蛋白或基于血红蛋白的血液代用品。
8.权利要求7的方法，其中血液代用品含有一种衍生的，多聚化的，经修饰或交联的人类血红蛋白，牛血红蛋白或一种重组生产的血红蛋白。
9.前述权利要求之一所要求的方法，其样品含有最高达6500mg/dl的血红蛋白。
10.用于在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离的血红蛋白或血液代用品所造成的干扰的方法，其中450±10nm被用作主测波长，并且使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。
11.一种主测波长450±10nm同次波长480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种的组合的应用，以在测定碱性磷酸酶的方法中消除游离的血红蛋白或血液代用品所造成的干扰。
99814175.5说 明 书第1/9页用于测定碱性磷酸酶和消除血红蛋白干扰的方法
本发明涉及到一种用于通过光学测量测定一个样品中的碱性磷酸酶的方法，该方法通过特定波长组合的手段消除了游离的血红蛋白或血液代用品的干扰，本发明还涉及到一种在碱性磷酸酶的测定中消除游离的血红蛋白或血液代用品的干扰的方法以及特定波长的组合在消除游离的血红蛋白或血液代用品
的干扰中的使用。 溶血作用已知可以严重干扰一些用于测定分析的诊断方法。溶血作用被理解为红血球的任何的损坏，例如，通过机械，渗透压，化学和酶对红血球细胞膜的作用而造成的损坏。作为溶血作用的后果，血素血红蛋白(Hb)被释放并且不能从样品中去除。血红蛋白的存在是有问题的，这是因为，一方面，在一些情况下血红蛋白的吸收光谱同被检测的物质和指示剂(生原)的吸收光谱有较大的重叠，这可导致在光度检测中的错误。在另一方面，血红蛋白还可以同样品成分发生化学反应而形成也可导致失败的测量的物质。
近来，基于血红蛋白而制造的血液代用品(Blutersatzmittel)被越来越频繁的用于医疗目的，例如在大量失血后使用。血液代用品中的血红蛋白可以是天然的或合成的。通常还使用了类似Hb的化合物。同溶血作用相比，在以血液代用品进行的中血液、血清或血浆中的Hb成分可能高于2000mg/dl。因此含有血液代用品的样品中的干扰通常比发生溶血的样品更加显著，这是因为从一开始血红蛋白或其合成的类似物就处于游离状态。
游离的血红蛋白所造成的干扰在对碱性磷酸酶的光度测定中尤其严重。在415nm下测量4-硝基酚的形成(吸光度的增加)以测定碱性磷酸酶。血红蛋白在415nm下也有吸收。血红蛋白的存在在两方面干扰了碱性磷酸酶的测定：一方面，在碱性环境中，Hb的光谱以一种时间依赖的方式变化(吸光度增加)，另一方面，超过一特定的Hb 含量时测量设备将达到光度计的极限。
此前的工艺中已有多种在血清或血浆样品的分析中消除血红蛋白光谱和化学影响的方法发表。
由于在自动分析仪上操作简单，除第一种测量波长(主波长
(HauptmeBwellenl nge))外，通常还使用第二种测量波长(次波长(HebenmeBwellenl nge))以消除诸如血红蛋白、胆红素和脂血这样的干扰物质的干扰效应或至少使该效应最小化。在Clin.Chem. 25/6，951-959(1979)中Hahn等人提及次波长必须被选择以使其接近生原的最小吸收和干扰物质的最大吸收。但是，使用所提及的测量程序以消除碱性磷酸酶测定中的干扰是不可能的。
Jay和Provasek在C1in.Chem.39/9，1804-1810(1993)中述及碱性磷酸酶测定中的溶血作用干扰是由于Hb光谱的时间依赖的变化所导致。该干扰可通过数学校正算法确定(测定样品中Hb浓度，在一定量下，校正碱性磷酸酶的测定值，该定量与测定的Hb量相等)。 Jay和Provasek提及的数学校正消除了可达至少800mg/dL Hg 的干扰，然而，使用户困挠的是，需要另外测定Hb含量，随后还需额外的数学校正步骤。
Jay和Provasek(见上文)还描述了通过速率空白法消除干扰的方法。
通过速率空白(rate-blank)测量以校正溶血作用干扰也在EP-A-0695805中有描述。在该方法中，在对样品中的一个组分进行实际的光度测定之前对样品进行预反应以测定样品的溶血作用的程度。随后获得的测量值以一个数值对进行校正，用于校正的该数值通过将溶血程度同干扰物质在测量误差中的作用量相联系而确定。 Hb干扰可以通过速率空白测量而消除，但最高只限于Hb含量为ca.1200mg/dl，这
是由于在更高的Hb含量下达到了光度计的极限。这对于消除溶血作用的干扰可能足够，但根本不足以消除血液代用品所造成的干扰。
另一种在白蛋白测定中消除血红蛋白干扰的方法也被公布(PCT 申请WO 97/45728)，该方法通过主波长和次波长的特定组合达到了对血红蛋白干扰的消除。但是，在该PCT申请中所提及的波长组合不能用于碱性磷酸酶测定，这是由于在这些波长下不能获得4一硝基酚的测量信号。
待审的出版物WO 97/45733述及可以通过在单独的紫外测试中使用波长546和570可以消除血红蛋白的干扰。但是，该方法只能用于使用340nm主测量波长的的酶学紫外测试。尽管单独通过使用次波长
546或570nm可以达到对Hb干扰的完全消除，但这对于酶学生原的测试，例如波长在415nm范围内的碱性磷酸酶的检测是不可能的。 美国专利5,766,872提及577nm的次波长可在淀粉酶的测定中降低溶血作用的干扰。但是，被引用的测量数据表明在Hb含量为500mg /dl时测出的数值有达到8％的明显偏差。这对于消除溶血作用的干扰可能足够，但有可能在较高的Hb含量(例如在以血液代用品进行时的Hb含量)下，由于使用ca.415nm为主波长，这一测出的数值的偏差将变得更大并且对Hb干扰的消除不足。
在先前的领域中，在高浓度的Hb存在下，例如在含有血液代用品的样品中，没有任何方法已知可用于无干扰地测定碱性磷酸酶。 因此，本文目的为开发一种改进的方法以用于样品中的碱性磷酸酶的测
定，该方法能较大地克服先前工艺的不足。本文还特别意图提供一种简单并且对用户友好的方法以消除在测定碱性磷酸酶时血红蛋白和基于血红蛋白的血液代用品所造成的干扰。
通过一种方法该目的已经达到，该方法用于通过光学测量测定样品中的碱性磷酸酶，它在权利要求中有更详尽描述。该方法的特征在于使用450±10nm作为主测波长以及使用480±10nm，546±10nm或575±10nm中的至少一种作为次测波长。在优选情况下，只使用所述的次测波长中的一种。
令人惊奇的是，当变化主波长和刺激波长时，碱性磷酸酶的Hb 干扰可被有效地消除。对于Hb干扰的令人满意的消除，仅仅变化主波长或仅仅变化次波长是不够的。
由于4-硝基酚的吸收谱，测量碱性磷酸酶不仅可以在415nm下进行，而且在450±10nm也可进行。尽管此时主吸收波长不在检测反应通常的最大吸收处而是在其侧翼，但获得的测出信号对碱性磷酸酶的精确测定是足够的。
新的主测量波长450±10nm的选择已经导致了血红蛋白干扰的轻微减低，但只有将主波长450±10nm同次波长480±10nm、546±10nm 或575±10nm中的至少一种进行组合才能令人惊奇地获得对干扰的完全消除。次波长570nm被证明是特别适合的。次波长450±10nm已经证明非常适合于消除以ICFF法测定碱性磷酸酶时的血红蛋白干扰(实施例2)。
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