(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.05.21
C N 103805584
A (21)申请号 201310557286.9
(22)申请日 2013.11.11
201210450131.0 2012.11.12 CN
C12N 9/76(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
C12R 1/84(2006.01)
(71)申请人宜昌长江药业有限公司
地址443300 湖北省宜昌市宜都市滨江路
38号
(72)发明人高相雷 陈小锋 李利佳 林树珊
张鸿 徐军
(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人赵青朵
冯琼
(54)发明名称
(57)摘要
发明涉及生物技术领域，提供了一种重组胰
蛋白酶的纯化方法，该方法首先对酵母发酵生产
避免了直接从酵母发酵液中纯化胰蛋白酶原时需
对发酵液进行稀释或超滤的过程，且不必单独对
酶原进行酶切前处理，节省纯化步骤，操作简单，
产量较高；另外，本发明采用的层析填料价格便
宜，适合大规模生产。实验表明，本发明提供的重
组胰蛋白酶纯度和活性皆较高，可作为工业生产
原料。
(66)本国优先权数据
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书7页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图1页(10)申请公布号CN 103805584 A
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1.一种重组胰蛋白酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液；
步骤2：取所述含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液；
步骤3：取所述含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述活化具体为：取所述上清液，加入CaCl 2并调节pH 至7.0～8.5，室温下活化8小时～24小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CaCl 2在所述重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为10mmol/L ～100mmol/L 。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XAD1180、Rohmhaas XAD16或Rohmhaas XAD7HP 。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的填料为：GE SP-sepharose ff 、GE SP-sepharose HP 、GE SP-sepharose XL 、GE SP-sephadex C-25、GE SP-sephadex C-50、tosoh SP550、Bio-Rad UNOsphere s 、Bio-Rad rapid s 或Bio-Rad high s 。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的洗脱液为乙酸和NaCl 的水溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
步骤a ：获得的编码胰蛋白酶原基因；
步骤b ：取所述编码胰蛋白酶原基因，构建重组质粒；
步骤c ：取所述重组质粒，构建重组毕赤酵母菌株；
步骤d ：取所述重组毕赤酵母菌株，对重组胰蛋白酶原诱导表达，获得所述含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。权 利 要 求 书CN 103805584 A
一种重组胰蛋白酶纯化方法
[0001] 本申请要求于2012年11月12日提交中国专利局、申请号为201210450131.0、发明名称为“一种重组胰蛋白酶纯化方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组胰蛋白酶的纯化方法。
背景技术
[0003] 胰蛋白酶(Trypsin，EC3.4.21.4)属于丝氨酸蛋白酶，可特异性地切割碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸的羧基端肽键。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。其前体胰蛋白酶原在胰脏中合成并作为胰液的成分分泌，经肠激酶或胰蛋白酶的激活，成为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶还可以限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶。胰蛋白酶的主要商业用途是作为工业用酶用于重组人胰岛素的工业生产。
[0004] 最初，胰蛋白酶的生产是由猪、牛、羊等动物的胰脏中直接提取，在提取时，首先对胰脏中胰蛋白酶原进行活化，然后利用70%乙醇沉淀胰蛋白酶提取粗酶。但是，采用70%乙醇沉淀不仅会浪费大量有机溶剂，且提取效率较低；另外，从胰脏直接提取得到的胰蛋白酶中往往混合有其他酶类，造成特异性的下降，因而自上世纪80年代以来，从不同生物中重组生产胰蛋白酶的方法被广泛的应用。
[0005] 早期，人们采用大肠杆菌作为重组胰蛋白酶的表达载体，例如，国际专利WO99/10503中就采用了这种方法，然而，由于原核生物外源基因的高表达特性，造成了包涵体的产生，从而使该产物的纯化过程中需加入变性和复性过程，增加了纯化的复杂性，不适合大规模工业化生产。
[0006] 随后，在欧洲专利EP1399568B1提供的方法中，真核生物毕赤酵母作为表达载体的使用有效避免了包涵体的产生，该方法通过阳离子交换树脂对发酵液进行纯化得到胰蛋白酶原，然后调节pH值对酶原进行活化。但是毕赤酵母发酵液上清电导率较高，一般为15ms/cm～30ms/cm，而离子交换层析填料通常只有在料液电导率<5ms/cm条件下才能进行捕获。因此毕赤酵母发酵液需要进行稀释或超滤后才能使用阳离子交换树脂捕获酶原，但采用超滤的方法并不适合大规模生产，而纯化前的稀释过程会在进行大规模生产时造成极大的水资源浪费，而且稀释后体积增大，导致纯化时间的延长。
[0007] Macouzet M等人在重组胰蛋白酶原的C端融合了一段组氨酸标签，并通过对组氨酸标签的识别对重组胰蛋白酶原进行纯化，简化了纯化过程，且可避免在纯化过程中对发酵液进行稀释或超滤，但引入的组氨酸标签无法彻底去除，残留的组氨酸标签易对后期工业应用产生影响。
发明内容
[0008] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组胰蛋白酶纯化方法，本发明提供的方法产量高，所生产的胰蛋白酶主要用于工业用途，该方法操作简便，且简化了纯化步骤，适合大规模生
产。
[0009] 本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，该方法包括以下步骤：
[0010] 步骤1：获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液；
[0011] 步骤2：取含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液；
[0012] 步骤3：取含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。
[0013] 作为优选，对胰蛋白酶原的活化具体为：取上清液，加入CaCl2并调节pH至7.0～8.5，室温下活化8小时～24小时。或在上清液中加入胰酶和/或肠激酶进行活化。本发明选择不加入胰酶和/或肠激酶进行活化。
[0014] 优选地，CaCl2在重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为10mmol/L～100mmol/L。[0015] 本发明首先对发酵液进行分离和活化处理，不需要从发酵液中纯化重组胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤，也避免了先从发酵液中纯化胰蛋白酶原再活化胰酶后再次纯化的过程，简化了纯化步骤。
[0016] 优选地，对含有重组胰蛋白酶的溶液的纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
[0017] 优选地，大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XAD1180、Rohmhaas XAD16或Rohmhaas XAD7HP。
[0018] 优选地，大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
[0019] 优选地，大孔吸附树脂层析洗脱液的配制方法为：分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:0.7～1.2的体积比混合，即得。
[0020] 优选地，阳离子交换层析采用的填料为：GE SP-sepharose ff、GE SP-sepharose HP、GE SP-sepharose XL、GE SP-sephadex C-25、GE SP-sephadex C-50、tosoh SP550、Bio-Rad UNOsphere s、Bio-Rad rapid s或Bio-Rad high s。
[0021] 优选地，阳离子交换层析采用的洗脱液为乙酸和NaCl的水溶液。
[0022] 优选地，阳离子交换层析洗脱液的配制方法为：分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为1mol/L的NaCl溶液，分别以1:0.8～1.2的体积比混合，即得。[0023] 优选地，重组胰蛋白酶的纯化方法中的步骤1具体为：
[0024] 步骤a：获得的编码胰蛋白酶原基因；
[0025] 步骤b：取编码胰蛋白酶原基因，构建重组质粒；
[0026] 步骤c：取重组质粒，构建重组毕赤酵母菌株；
[0027] 步骤d：取重组毕赤酵母菌株，对重组胰蛋白酶原诱导表达，获得所述含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。
[0028] 与现有技术相比，本发明提供的纯化方法首先对酵母发酵生产的重组胰蛋白酶原进行活化处理后采用大孔吸附树脂和阳离子交换层析进行纯化得到纯的胰蛋白酶。避免了直接从酵母发酵液中纯化胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤的过程，且不必单独对酶原进行酶切前处理，节省了纯化步骤，操作简单，且产量较高；另外，本发明采用的层析填料价格便宜，适合大规模生产。检测结果表明，本发明提供的重组胰蛋白酶纯度和活性皆较
高，可满足作为工业生产原料的需求。
附图说明
[0029] 图1所示为本发明实施例5提供的重组胰蛋白酶的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为蛋白质低分子量Marker；泳道1为重组胰蛋白酶标品，泳道2为本发明实施例5提供的重组胰蛋白酶。
具体实施方式
[0030] 本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031] 本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，该方法包括以下步骤：首先，获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液；然后，取含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液；然后，取含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。[0032] 其中，对胰蛋白酶原的活化具体为：取上清液，加入CaCl2并调节pH至7.0～8.5，室温下活化8小时～24小时。
[0033] 获得上清液的方式为微滤、离心或过滤。
[0034] 为提高活化效果，CaCl2在重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为10mmol/L～100mmol/L。
[0035] 为进一步提高活化效果，可在上清液中加入胰酶和/或肠激酶。
[0036] 本发明首先对发酵液进行分离和活化处理，不需要从发酵液中纯化重组胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤，也避免了先从发酵液中纯化胰蛋白酶原再活化胰酶后再次纯化的过程，简化了纯化步骤。
[0037] 为了在提高纯度的同时简化操作步骤，本发明提供的纯化方法中对含有重组胰蛋白酶的溶液的纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
[0038] 具体地，大孔吸附树脂层析的步骤为：首先，取含有重组胰蛋白酶的溶液上样至大孔吸附树脂柱；然后，用Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线；然后，用乙醇、乙酸和水的混合液对大孔吸附树脂柱进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液。
[0039] 为达到更好的纯化效果，大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XAD1180、Rohmhaas XAD16或Rohmhaas XAD7HP。
[0040] 其中，大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
[0041] 大孔吸附树脂层析洗脱液的配制方法为：分别取体积分数为15%的乙醇水溶液和体积分数为20%的乙酸水溶液，以1:0.7～1.2的体积比混合，即得。
[0042] 另外，阳离子交换层析的具体步骤为：首先，取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱；然后，用乙酸水溶液冲洗阳离子交换层析树脂柱至基线；然后，用乙酸和NaCl的水溶液进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液。
[0043] 阳离子交换层析采用的填料为：GE SP-sepharose ff、GE SP-sepharose HP、GE
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