一种川贝母活性成分的提取方法及其抗支气管炎用途与流程

1.本发明属于防治急慢性支气管炎作用的化合物, 涉及一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素的提取方法和应用，属于呼吸系统相关的药物领域。

背景技术：

2.急慢性支气管炎（aacb）是指气管、支气管黏膜及其周围组织的急性或慢性非特异性炎症。其中急性支气管炎起病较急，常发病于寒冷季节或气温突然降低时，若久治未愈或治愈后仍反复发作，则有可能发展为慢性支气管炎，伴有长期、反复、逐渐加重的咳嗽，部分加重者则可能演化成其他疾病。慢性阻塞性肺疾病（copd）就是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎，可进一步发展为肺心病和的常见慢性疾病。全球40岁以上人的发病率已高达9%~10%。支气管炎和copd是呼吸系统最常见的两种疾病，是呼吸道及肺脏内的异常炎症反应所造成内体活性氧的增加，进而引起细胞的凋亡一系列复杂的机制，而后者则兼具不可逆性气道阻塞。目前普遍认为是在环境和遗传因素相互作用的多基因疾病。
3.目前西药对抗呼吸道疾病主要通过对症合并抗感染，起效快，但容易复发，病程反复，且多药联用副作用大、长期用药患者经济负担较重。在当代绿大健康背景下大众对于安全有效的天然药物的需求广泛存在，而天然新药开发这块尚属空白。贝母作为有临床应用百年历史的珍贵药材，其药效物质基础研究还在大力发展，而其活性成分生物碱有被分离得到，可对其药效应用开发进行实验验证，拓宽了贝母属植物的新应用病症范围，为安全有效的防治急慢性支气管炎、copd作新药物的开发提供了可靠的方向和基础。

技术实现要素：

4.本发明涉及一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素提取方法及其制备防治急慢性支气管炎药物中的用途。
5.本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供了一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素的提取方法。
6.本发明的目的在于：提供一种具有防治急慢性支气管炎的用途，但不限于上述疾病的源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素。
7.本发明的另一个目的在于：提供一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素在药学上可以接受的盐的防治急慢性支气管炎用途，但不限于上述疾病。
8.本发明上述的目的通过以下的技术方案实现：本发明提供一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素化合物，其结构式如下所示：
。
9.实验证明, 通过试验证明了贝母乙素对cse引起beas-2b细胞体内活性氧、脂质氧化产物、以及凋亡情况的作用。实验证明贝母乙素能降低cse引起beas-2b细胞脂质氧化产物丙二醛增加、以及凋亡和自然凋亡的减少。与文献报到的其它药物相比，效果显著。
10.以下通过实例对本发明进一步详细的说明，但本发明发保护范围不受具体实施的任何限制，而是由权利要求加以限制。
附图说明
11.图1为贝母乙素分别在10、20、40 μm对cse诱导的beas-2b细胞活性氧的抑制作用。
12.图2为贝母乙素分别在10、20、40 μm对cse诱导的beas-2b细胞脂质氧化产物丙二醛的抑制作用。
13.图3为beas-2b细胞自然凋亡，cse诱导的beas-2b细胞凋亡及贝母乙素分别在10、20、40 μm时对细胞凋亡的抑制作用。
具体实施方式
14.实施例1：贝母乙素的提取方法：方法：将瓦布贝母干燥鳞茎打成粉，用90%乙醇连续回流4h，过滤，滤液减压浓缩。浸膏用2% hcl溶解，过滤，滤液用石油醚萃取脱脂后，用浓氨水调至ph=10，依次用二氯甲烷和水饱和正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到二氯甲烷层提取物和正丁醇提取物。二氯甲烷提取物用硅胶柱层析分离，分别用石油醚-丙酮-二乙胺（20：1：0.1~1：5：0.1）、二氯甲烷-甲醇-二乙胺（2：1：5
‰
），共得到7个部分（frs.1~7）。fr.3经硅胶柱层析分离，石油醚-丙酮-二乙胺（5：2：0.1）得到frs.3-1~3-4。fr.3-4经反相制备谱得到贝母乙素。
15.实施例2：dcfh-da荧光探针测定beas-2b细胞活性氧的含量。
16.方法：取对数生长期beas-2b细胞，按5
×
105个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24 h至70%汇合度时，加入基础培养基稀释的cse培养液，另设阳性对照组，每个浓度设置3个复孔。24 h后，按照1:1500用基础培养基稀释dcfh-da，去除细胞培养上清并用pbs清洗两次后，按照500 μl/孔加入稀释好的dcfh-da探针，阴性对照组加入同体积空白培养基，37℃黑暗情况下孵育30min。去除上清，用无菌pbs轻轻清洗细胞3次以充分去除未结合的荧光探针以免荧光背景过高，消化收集, 1200 g/min离心4 min收集细胞沉淀，加入200 μl pbs重悬细胞，避光等待上机检测。使用488 nm激发波长，525nm发射波长，也可用fitc参数直接检测。计算荧光强度值并进行比较。
17.结果: 贝母乙素对cse引起beas-2b细胞中脂质氧化产物丙二醛的量增加有抑制作用。在不同剂量的生物碱作用下，各给药组的荧光强度均有显著下降，在10μm剂量下即可
有效降低细胞中的脂质氧化产物丙二醛生成。
18.实施例3：膜脂过氧化产物丙二醛（mda）水平变化的测定。
19.方法：取对数生长期beas-2b细胞，按照5
×
105个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24h至70%汇合度时，加入基础培养基稀释的cse培养液，另设对照组，每个浓度设置3个复孔。24h后用pbs洗涤细胞样品一次，按每107/ml个的比例加入ripa冰浴裂解30 min后12000 r/min 4℃离心10 min，取上清作为后续样品。按照试剂盒说明书配制反应体系沸水浴15 min后1000 r/min 室温离心10 min，取200 μl上清至新96孔板中于540 nm处测定吸光度，并计算样品中的脂质氧化产物丙二醛含量（μm/mg）。
20.结果：cse的干预会显著升高beas-2b细胞中脂质氧化产物丙二醛的含量，造成细胞的氧化损伤。贝母乙素在10μm时能下调细胞中的脂质氧化产物丙二醛含量，40 μm时效果更佳。
21.实施例4：annexin v& pi双染法测定beas-2b细胞的凋亡情况。
22.方法：取对数生长期beas-2b细胞，按照1
×
106个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24h至70%汇合度时，另设对照组、单染组、实验组。加入基础培养基稀释的cse培养液， 24h后吸取培养板中的上清液转移至微型管中保存，用pbs洗细胞2次，收集清洗液保存。用不含edta的胰蛋白酶消化细胞2min，用完全培养基终止消化，将上清液、pbs、细胞悬液转移至离心管中，一并加入。在1,200 rpm，离心4min，弃上清，重复本步操作一遍。加入预先配好的1
×
annexin v binding solution，制成终浓度为1
×
106个/ml的细胞悬液。取100 μl细胞悬液，加入到新的tube中, 避光下向细胞悬液中加入5 μl annexin v, fitc结合物，再加入5 μl的pi solution。在室温下避光培养15 min。加入400 μl 1
×
annexin v binding solution，在 1 h内避光等待上机检测。
23.结果：贝母乙素在10μm就已经有较好的抗cse诱导的凋亡作用，与cse组相比，在10、20、40μm均具有较好的抑制cse引起的细胞凋亡；与空白组相比，还可以抵抗细胞的自然凋亡。
24.由上述实例表明，本发明的化合物对防治急慢性支气管炎有较好作用。
25.以上通过实例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限制。

技术特征：

1.一种源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素的提取方法及其在制备、缓解或预防慢性支气管炎药物中的用途，其特征在于，所述的源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素，其结构如式i所示：式i。2.根据权利要求1所述的源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素, 其特征在于，贝母乙素的提取方法。3.如权利要求2所述结构式为源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素或其在药学上可以接受的盐及其构成的制剂用在、缓解或预防慢性支气管炎的用途。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的复方药物中所含化合物贝母乙素作为主要成分或非主要成分用于、缓解或预防急慢性支气管炎。5.根据权利要求4所述源于川贝母的异甾体生物碱单体贝母乙素在制备用于、缓解或预防包括理化因素和病毒感染引起的急慢性支气管炎药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所诉的疾病包括但不限于急慢性支气管炎。

技术总结

本发明涉及用于、缓解或预防急慢性支气管炎药学技术领域，具体而言，本发明涉及源于川贝母的异甾体生物碱单体，具有式Ⅰ结构式的化合物贝母乙素的、缓解或预防急慢性支气管炎的活性用途。本发明通过体外烟雾提取物（CSE）对人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）活性氧、脂质氧化产物丙二醛以及抗凋亡和抗自然凋亡活性评价，发现式Ⅰ结构所示的化合物对CSE影响的BEAS-2B细胞具有显著的作用。该化合物能用于制备、缓解或预防急慢性支气管炎药物具有良好的开发应用前景。式Ⅰ：。。