一种葡萄复合组织外囊泡及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于细胞及分子生物学技术领域，尤其涉及一种葡萄复合组织外囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)，主要包括外泌体、微囊泡，曾经被认为是细胞向外运输物质的“垃圾袋”，直到1996年raposo等发现b细胞的外泌体可以激活t细胞，具有实质性的生物学作用，自此外囊泡的生物学价值开始被发掘。在2013年，作为研究外囊泡结构及其运输和调控机制的先驱，jamese.rothman，randy w.schekman和thomas c.s
ü
dhof获得了诺贝尔生理或医学奖。
3.经过广泛的研究发现，几乎所有类型的细胞，包括原核细胞和真核细胞，在生命过程中均可产生并释放细胞外囊泡。外囊泡根据直径大小和产生方式可分为外泌体(exosomes)和微囊泡(microvesicle)，其直径分别为40～200nm(平均100nm)和200～500nm，均具有双层膜结构，内含丰富的成份，包括rna (snrna，mirna，lncrna，cirrna，mrna等)、dna(gdna，mtdna等) 以及蛋白和脂质，在细胞间信号传导及分子传递方面发挥重要作用。外囊泡广泛存在于细胞培养上清液及各种体液中，包括血液、淋巴液等，同时也大量存在于植物组织内部的汁液中。
4.外囊泡是高度细胞异质性的体，其内含的rna和蛋白质均与其来源细胞密切相关，因此具有独特的诱导复杂生物学反应的能力，可以实现部分源细胞的生物学功能。例如，在临床方面，msc(mesenchymal stem cell，间充质干细胞)产生的外囊泡可以透过bbb(blood brain barrier，血脑屏障)，实现对脑卒中、帕金森等脑部疾病的；在临床检测方面，外囊泡作为检测标的，已成为肿瘤早期检测的重要选项；最近的研究还发现植物细胞来源的外囊泡在体内可通过肠脑轴间接调节免疫和神经系统，因此外囊泡已显示出巨大医学价值和应用潜力。
5.鉴于外囊泡的广阔医学前景，如何获取更大量的外囊泡以及提升外囊泡在应用中的效率，是当前世界科研人员致力研究的方向，尤其在药物载体、肠脑轴调节等方面的应用，均需要数量巨大的外囊泡。但包括人类在内的哺乳类生物，其外囊泡获取始终存在成本高、耗时、产量相对较低以及可能涉及伦理等问题的制约，因此植物来源的外囊泡具有独到的优势。由于细胞壁的存在，植物的细胞结构和组织结构与人体的细胞及组织结构存在明显差异，并且植物的部分组织在脱离原机体后在相当一段时间内依然存在活性，因此基于植物的生物学特异性，针对性开发更高效的外囊泡富集技术，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄复合组织外囊泡及其制备方法和应用，用于提升植物外囊泡提取效率。
7.本发明技术方案如下：
8.一种葡萄复合组织外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
9.a)将葡萄果实先后置于2～8℃、0℃冰浴和45～55℃的温度条件下进行连续切换式预处理，再将所述葡萄果实进行组织分离得到葡萄果皮和葡萄籽；
10.b)将所述葡萄果皮和所述葡萄籽分别研磨得到葡萄果皮研磨产物和葡萄籽研磨产物；
11.c)将所述葡萄果皮研磨产物及所述葡萄籽研磨产物分别进行第一阶段离心得到葡萄果皮上清液、葡萄籽上清液和葡萄籽沉淀；
12.d)将所述葡萄果皮上清液、所述葡萄籽上清液和所述葡萄籽沉淀重悬混合后，进行第二阶段离心得到复合组织上清液；
13.e)将所述复合组织上清液进行第三阶段离心去除上清液，得到葡萄复合组织外囊泡。
14.本发明以葡萄为外囊泡的来源，通过先后置于2～8℃、冰浴0℃和45～55℃温度条件下进行预处理，对果实的不同组织分别研磨，以及不同组织比例的组合，再进行梯度离心，从而获得更大量的外囊泡，该制备方法对葡萄外囊泡的富集效率高，制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了成本经济性和操作安全性；使用含有本发明制得的葡萄复合组织外囊泡的抗衰老细胞培养制剂进行内皮祖细胞的培养，结果表明该抗衰老细胞培养制剂对内皮祖细胞的nrf2信号通道活性有显著的提升作用，nrf2信号通道与干细胞的增殖和分化，以及皮肤组织，例如表皮层真皮层细胞，消化道(食道，肠道等)内皮细胞等多种类型细胞的生物学功能密切相关，而内皮祖细胞在皮肤组织再生过程中具有举足轻重的作用，因此葡萄复合组织外囊泡可用于改善皮肤组织(包括体表皮肤和消化道内表面)的细胞衰老状态，进而维持细胞活性，为临床应用提供了更可靠的支持。本发明使用赤霞珠葡萄为实验基础，但本发明的技术体系和葡萄复合组织外囊泡制备方式同样适用于其他葡萄品种。
15.优选的，步骤a)所述预处理的次数为两次及以上；
16.所述置于2～8℃的时间为2～16h；
17.所述置于0℃冰浴的时间为5～10min；
18.所述置于45～55℃的时间为10～30min。
19.优选的，步骤a)置于45～55℃具体为置于45～55℃的电热红外加热环境。
20.优选的，步骤b)所述研磨的温度为8～24℃；
21.所述研磨的总时间为2～12min。
22.优选的，步骤c)所述第一阶段离心的离心力为800～1200g；
23.所述第一阶段离心的温度为20～30℃；
24.所述第一阶段离心的时间为6～12min。
25.优选的，步骤d)所述第二阶段离心为两步离心；
26.第一步的离心力为800～1200g，温度为20～25℃，时间为10～30min；
27.第二步的离心力为2600～3200g，温度为20～25℃，时间为15～30min。
28.更优选的，步骤d)所述第二阶段离心为两步离心，第一步的离心力为1200 g，温度为25℃，时间为10min；第二步的离心力为3000g，温度为25℃，时间为20min。
29.优选的，步骤e)所述第三阶段离心为两步离心；
30.第一步的离心力为9000～11000g，温度为20～25℃，时间为40～60min；
31.第二步的离心力为100000～110000g，温度为4℃，时间为100～120min。
32.更优选的，步骤e)所述第三阶段离心为两步离心，第一步的离心力为10000 g，温度为25℃，时间为45min；第二步的离心力为110000g，温度为4℃，时间为100min。
33.更具体的，本发明葡萄复合组织外囊泡的制备方法，采用赤霞珠葡萄 (cabernet sauvignon)作为实验基础，包括以下步骤：
34.(1)果实组织预处理
35.①
本发明以赤霞珠(cabernet sauvignon)葡萄为实验基础，操作过程步骤对其他葡萄品种同样适用。把葡萄(整串)放置在4℃环境，放置2小时以上，取出后置于50℃电热红外加热环境中，均匀受热20min；
36.②
把加热完毕的赤霞珠葡萄(整串)立即放置于4℃环境，冷藏30min后取出并立即置于冰浴中5min，然后再放置于50℃电热红外加热环境中(碳纤维热源，220v～50hz，800w)，均匀受热20min；
37.③
把整串赤霞珠葡萄分拆为小串，放置于超声波清洗仪中(频率38khz，220v ～，50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min，取出后超纯水冲洗2次。
38.(2)果实组织分离
39.①
将赤霞珠葡萄逐颗剥开，葡萄果皮和葡萄籽分别存放，葡萄果肉废弃；
40.②
葡萄果皮用超纯水清洗两遍后放置于超声波清洗仪中(频率38khz，220v ～,50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min；
41.③
葡萄籽超纯水清洗两遍；
42.(3)果实组织破碎
43.①
葡萄果皮置于研磨器中，8℃温度环境下，用低温破壁机(工作温度不超过30℃)研磨2min，静止1min后再研磨2min，直至研磨产物均匀，总研磨耗时不超过8min，取出葡萄果皮研磨产物，超纯水充分混合后定容；
44.②
葡萄籽置于研磨器中，8℃温度环境下用低温破壁机(工作温度不超过 30℃)研磨1min，静止2min后再研磨1min，合计研磨耗时不超过12min，取出葡萄籽研磨产物，超纯水充分混合后定容；
45.(4)离心第一阶段
46.①
葡萄果皮研磨产物，1000g常温离心8min，去除沉淀，获得葡萄果皮上清液a；
47.②
葡萄籽研磨产物，1200g常温离心10min，收集上清液，获得葡萄籽上清液b，葡萄籽沉淀暂存备用；
48.(5)离心第二阶段
49.①
葡萄果皮上清液a和葡萄籽上清液b混合后，重新与葡萄籽沉淀震荡混合，静止10min，1200g常温离心10min，去除沉淀，获得c；
50.②
c进行3000g常温离心20min，获得d；
51.(6)离心第三阶段
52.①
d进行10000g常温离心45min，获得e；
53.②
e进行110000g，4℃低温离心100min，弃上清，其沉淀即为葡萄复合组织外囊泡
f，为葡萄果皮和葡萄籽外囊泡的混合物。
54.本发明中，将赤霞珠葡萄(整串)经过不同温度环境的连续切换后，进行短时间超声波处理；然后逐颗把葡萄剥开，葡萄果皮、葡萄果肉和葡萄籽分别存放；葡萄果皮和葡萄籽分别置于研磨器中研磨破壁，随后经过不同的离心速率和时间进行离心和叠加式提取，葡萄果皮研磨产物经低速离心后，与葡萄果籽研磨产物混合再进行中速离心，然后进行高速和超高速离心，从而获得更大量外囊泡。实验结果表明，该制备方法制得的葡萄复合组织外囊泡对内皮祖细胞的nrf 2信号通道活性有明显的提升作用，nrf2信号通道在干细胞的增殖和分化以及内皮祖细胞在皮肤组织再生过程中均发挥重要作用，因此葡萄复合组织外囊泡可用于改善皮肤组织的衰老状态和维持细胞活性。
55.本发明还提供了一种葡萄复合组织外囊泡，由上述技术方案所述制备方法制得。
56.1996年，raposo发现b细胞的外囊泡可以激活t细胞，揭示了外囊泡及其内含物在细胞生命过程中的重要作用。目前已证实外囊泡在药物载体、检测标的以及直接充当临床手段等方面均有巨大的医学价值。外囊泡内含物，包括snrna，mirna，lncrna，cirrna，mrna，gdna，mtdna等，均为细胞的生物学过程中必不可少的生物信息，在细胞之间的物质传递和信息传导发挥直接作用，对细胞状态和功能的调控至关重要。
57.不同类型细胞来源的外囊泡，其内含物有明显差异，相对于人体细胞，植物细胞来源的外囊泡在获得的方便性、生物相容性、内含物稳定性和细胞内化等方面都表现出显著的优势，因此进行生物工程处理具有更大实用价值，植物外囊泡甚至可以抑制有害细菌，如牙龈卟啉单胞菌等。
58.本发明以内皮祖细胞为细胞模型进行抗衰老效果的检测，结果表明本发明制得的葡萄复合组织外囊泡对内皮祖细胞的nrf 2信号通道活性有明显的提升作用，具有改善皮肤组织的衰老状态和维持细胞活性的效能。
59.本发明还提供了一种抗衰老制剂体系，包括上述技术方案所述葡萄复合组织外囊泡。
60.本发明还提供了一种抗衰老制剂体系，包括培养基、fbs、l-glu、vegf、 bfgf、igf-1、il-1β和上述技术方案所述葡萄复合组织外囊泡；
61.fbs的浓度为8～12％，l-glu的浓度为1～2％，vegf的浓度为20～50ng/ml， bfgf的浓度为1～4ng/ml，igf-1的浓度为1～4ng/ml，il-1β的浓度为0.5～2 ng/ml，所述葡萄复合组织外囊泡的浓度为0.1～0.5mg/ml。
62.本发明通过连续的预处理过程，对葡萄不同组织的外囊泡进行综合制备，不单获得大量的外囊泡，同时证实了含有该外囊泡的抗衰老制剂体系具有提升 nrf 2信号通道活性的作用，从而具有改善皮肤组织相关细胞的衰老状态以及维持细胞活性的效果。采用该本发明进行内皮祖细胞抗衰老的操作简便，成本低，得到的内皮祖细胞状态良好，安全性高。
63.综上所述，本发明提供了一种葡萄复合组织外囊泡及其制备方法和应用，该葡萄复合组织外囊泡制备方法以葡萄为外囊泡的来源，通过先后置于2～8℃、 0℃冰浴和45～55℃温度条件下进行连续切换式预处理，对果实的果皮和果籽的不同组织分别研磨，以及不同组织的比例组合，再进行梯度离心，获得大量的外囊泡，更充分利用了植物资源，该方法制备过程不需要添加任何化学试剂，操作简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了
成本经济性和操作安全性，结果表明本发明制得的葡萄复合组织外囊泡对内皮祖细胞nrf2信号通道活性有明显的提升作用，因此具有改善皮肤组织的衰老状态和维持细胞活性的作用。
附图说明
64.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
65.图1为本发明实施例1葡萄外囊泡(control组)的表面标记检测结果图；
66.图2为本发明实施例4各组内皮祖细胞的形态图(局部)；
67.图3为本发明实施例4各组内皮祖细胞中nrf2信号通道的western blot检测结果图。
具体实施方式
68.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
69.具体实施例中，采用同一批次相近总体成熟度的新鲜赤霞珠葡萄，摘除破损果实后备用，分组中葡萄组织的成分如表1所示。
70.表1分组中葡萄组织的成分
71.组别基础成分总重量(g)control组葡萄果皮200
±
2a组葡萄果皮200
±
2b组葡萄果皮及葡萄籽200
±272.实施例1
73.葡萄采购后立即运回实验室，运输温度保持在4～8℃。将葡萄按表1分为 control组、a组和b组，control组、a组制得葡萄果皮外囊泡，b组制得葡萄复合组织外囊泡，b组按以下方法进行葡萄复合组织外囊泡制备操作：
74.(1)果实组织预处理
75.①
day 0，把整串赤霞珠葡萄放置在4℃环境(最少放置2小时)；
76.②
day 1取出，置于电热红外加热环境(碳纤维热源，220v～50hz，800w)，均匀受热20min；
77.③
把加热完毕的整串赤霞珠葡萄立即放置于4℃环境，冷藏30min后取出并立即置于冰浴中5min；
78.④
把整串赤霞珠葡萄再放置于电热红外加热环境(碳纤维热源，220v ～50hz，800w)，均匀受热20min；
79.⑤
把整串赤霞珠葡萄分拆为小串，放置于超声波清洗仪中(频率38khz， 220v～,50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min，取出后超纯水冲洗2次。
80.(2)果实组织分离
81.①
将赤霞珠葡萄逐颗剥开，葡萄果皮和葡萄籽分别存放，葡萄果肉废弃；
82.②
葡萄果皮用超纯水清洗两遍后放置于超声波清洗仪中(频率38khz，220v ～,50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min；
83.③
葡萄籽超纯水清洗两遍；
84.(3)果实组织破碎
85.①
葡萄果皮置于研磨器中，8℃温度环境下，用低温破壁机(工作温度不超过30℃)研磨2min，静止1min后再研磨2min，总研磨耗时不超过8min，取出葡萄果皮研磨产物，超纯水充分混合后定容；
86.②
葡萄籽置于研磨器中，8℃温度环境下，用低温破壁机(工作温度不超过30℃)研磨1min，静止2min后再研磨1min，总研磨耗时不超过12min，取出葡萄籽研磨产物，超纯水充分混合后定容；
87.(4)离心第一阶段
88.①
葡萄果皮研磨产物，1000g常温进行离心8min，去除沉淀，获得葡萄果皮上清液a；
89.②
葡萄籽研磨产物，1200g常温进行离心10min，收集上清液，获得葡萄籽上清液b，葡萄籽沉淀暂存备用；
90.(5)离心第二阶段
91.①
葡萄果皮上清液a和葡萄籽上清液b混合后，重新与葡萄籽沉淀震荡混合，静止10min，1200g常温离心10min，去除沉淀，获得c；
92.②
c进行3000g常温离心20min，获得d；
93.(6)离心第三阶段
94.①
d进行10000g常温离心45min，获得e；
95.②
e进行110000g，4℃低温进行离心100min，弃上清，其沉淀即为葡萄外囊泡f，为葡萄果皮和葡萄籽外囊泡的混合物。
96.而control组不进行果实组织预处理，仅用超纯水清洗后进入步骤(2)，在后续步骤中control组只提取葡萄果皮，与a组一致；a组和b组均进行果实组织预处理；a组只含有葡萄果皮，在步骤(3)步骤(4)中只进行葡萄果皮的相关操作，步骤(5)省却
①
直接进行
②
；b组的葡萄果皮和葡萄籽来自相同的葡萄，即由每一颗葡萄所对应的葡萄果皮和葡萄籽组成；control组，a组和 b组总重量均为200g。
97.(7)葡萄外囊泡的理化性质鉴定
98.通过流式检测等鉴定葡萄外囊泡的理化性质，结果如图1、表2和表3所示，图1为本发明实施例1葡萄外囊泡(control组)的表面标记检测结果图，表2 为实施例1葡萄外囊泡(control组)的表面标记检测结果，表3为实施例1葡萄外囊泡终产量。结果表明a组与b组所获得的葡萄外囊泡总重量明显高于 control组，b组总重量同样明显高于a组。
99.表2实施例1葡萄外囊泡(control组)的表面标记测试结果
[0100][0101]
表3实施例1葡萄外囊泡终产量
[0102]
组别基础成分外囊泡总重量(mg)control组葡萄果皮313.2a组葡萄果皮437.3b组葡萄果皮及葡萄籽491.2
[0103]
实施例2
[0104]
参照实施例1的方法进行葡萄外囊泡的提取制备，control组，a组和b组总重量均为200g：
[0105]
(1)果实组织预处理
[0106]
整串赤霞珠葡萄在4℃环境与电热红外加热环境(碳纤维热源，220v～50hz， 800w)之间切换2次后，把整串赤霞珠葡萄分拆为小串，放置于超声波清洗仪中(频率38khz，220v～，50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min，取出后超纯水冲洗2次。
[0107]
(2)果实组织分离
[0108]
葡萄逐颗剥开，葡萄果皮和葡萄籽分别存放，葡萄果肉废弃；葡萄果皮用超纯水清洗两遍后放置于超声波清洗仪中(频率38khz，220v～，50hz，90w)，清洗液为超纯水，震荡5min；果籽超纯水清洗两遍；
[0109]
(3)果实组织破碎
[0110]
①
葡萄果皮置于研磨器中，8℃温度环境下，用低温破壁机(工作温度不超过30℃)研磨，总研磨时间不超过8min，取出葡萄果皮研磨产物，超纯水充分混合后定容；
[0111]
②
葡萄籽置于研磨器中，8℃温度环境下，用低温破壁机(工作温度不超过30℃)研磨，总研磨时间不超过12min，取出葡萄籽研磨产物，超纯水充分混合后定容；
[0112]
(4)离心第一阶段
[0113]
①
葡萄果皮研磨产物，1000g常温进行离心8min，去除沉淀，获得葡萄果皮上清液a；
[0114]
②
葡萄籽研磨产物，1200g常温进行离心10min，收集上清液，获得葡萄籽上清液b，葡萄籽沉淀暂存备用；
[0115]
(5)离心第二阶段
[0116]
①
葡萄果皮上清液a和葡萄籽上清液b混合后，重新与葡萄籽沉淀震荡混合，静止10min，1200g常温离心10min，去除沉淀，获得c；
[0117]
②
c进行3000g常温离心20min，获得d；
[0118]
(6)离心第三阶段
[0119]
①
d进行10000g常温离心45min，获得e；
[0120]
②
e进行110000g，4℃低温离心100min，弃上清，其沉淀即为葡萄外囊泡f，为葡萄果皮和葡萄籽外囊泡的混合物。
[0121]
对control组、a组和b组获得的葡萄外囊泡进行重量测定，结果如表4所示，表明a组与b组所获得的葡萄外囊泡总重量明显高于control组，b组总重量略高于a组。
[0122]
表4实施例2葡萄外囊泡终产量
[0123]
组别基础成分外囊泡总重量(mg)control葡萄果皮281.7a组葡萄果皮373.2b组葡萄果皮及葡萄籽392.1
[0124]
实施例3
[0125]
参照实施例1的方法进行葡萄外囊泡的提取制备，control组，a组和b组总重量均为200g，最终收获的葡萄外囊泡总重量如表5所示，表明a组与b组所获得的葡萄外囊泡总重量同样明显高于control组，b组总重量高于a组。
[0126]
表5实施例3葡萄外囊泡终产量
[0127][0128][0129]
请参阅表6，为实施例1～3葡萄外囊泡收获量对比结果。结果表明，预处理组的a组和b组，其葡萄外囊泡的平均获得量分别是control组的132.14％和 154.45％，均明显高于control组，具有统计学差异；相对于control组的外囊泡获得量，预处理组的b组其葡萄外囊泡的平均获得量比a组高22％。因此，经过本发明的预处理方法以及不同组织的不同比例组合对提高葡萄外囊泡的制备提取效果具有实质性效果。
[0130]
表6实施例1～3葡萄外囊泡收获量对比结果
[0131]
[0132]
实施例4
[0133]
将实施例1提取获得的control组，a组和b组葡萄外囊泡进行细胞共培养后，检测各组的nrf 2信号通道的表达差异，具体操作如下：
[0134]
以epc(endothelial progenitor cells，内皮祖细胞)为模型细胞，按6*105个为基础单位接种于t25细胞培养瓶中，培养基为m199，含有fbs、l-glu、 vegf、bfgf、igf-1和il-1β，终浓度分别为10％的fbs，1％的l-glu，以及vegf 40ng/ml，bfgf 2ng/ml，igf-1 2ng/ml，il-1β1ng/ml。共设4组，分别为blank，control，a组和b组。除blank组外，control组，a组和b组培养基中分别添加各组对应获得的葡萄外囊泡成分，终浓度为0.2mg/ml，进行96小时内皮祖细胞培养。
[0135]
day 0接种epc，置于37℃5％co2环境中培养；
[0136]
day 1分别把实施例1所提取的control组，a组和b组的葡萄外囊泡按照 0.2mg/ml的浓度分别添加到epc的control组，a组和b组中，epc blank组只添加等量体积的超纯水，充分摇晃混合。
[0137]
day 2观察细胞形态，epc数量明显比day 0密集，各个样本均同步增殖。
[0138]
day 3观察细胞形态，各个样本均继续增殖。
[0139]
day 4用胰酶(trypsin)消化细胞，细胞计数后，进行rt-pcr及western blot 检测。
[0140]
参阅图2，各样本细胞贴壁生长均匀，形态良好，证实含有葡萄复合组织外囊泡的抗衰老制剂体系的细胞培养安全性。
[0141]
各样本进行western blot检测，步骤如下：
[0142]
①
各样本的epc消化后，以800g离心5mins；
[0143]
②
trizol试剂提取总rna后，反转录为cdna(toyobo rt试剂盒)
[0144]
③
rt-pcr扩增。
[0145]
④
lysis缓冲液提取各个样本的蛋白，并在12000rpm 4℃状态下离心 11mins；
[0146]
⑤
bca(bicinchoninic acid)确认蛋白浓度，90℃加热6mins；
[0147]
⑥
在凝胶孔(sodium dodecyl sulfate
–
polyacrylamide gel electrophoresis) 中加入各样本并转移至pvdf膜上(polyviny lidenedifluoride)，静置2小时，用5％bsa终止。
[0148]
⑦
用pbs清洗样本，室温状态hrp标记90mins后检测。
[0149]
结果请参阅图3，为本发明实施例4各组内皮祖细胞中nrf2信号通道的 western blot检测结果图，结果表明control组，a组和b组的内皮祖细胞的nrf2 表达量均显著高于blank组，其中，a组和b组亮度明显强于control组，而b 组略强于a组；结果证明，在相同的外囊泡使用量前提下，经过温度预处理的葡萄果皮外囊泡对epc的nrf2信号通道活性有确切的提升效果，而经过温度预处理的葡萄果皮和葡萄籽复合组织所获得的葡萄外囊泡对epc的nrf2信号通道活性有更显著的提升作用。
[0150]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种葡萄复合组织外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a）将葡萄果实先后置于2~8℃、0℃冰浴和45~55℃的温度条件下进行连续切换式预处理，再将所述葡萄果实进行组织分离得到葡萄果皮和葡萄籽；b）将所述葡萄果皮和所述葡萄籽分别研磨得到葡萄果皮研磨产物和葡萄籽研磨产物；c）将所述葡萄果皮研磨产物及所述葡萄籽研磨产物分别进行第一阶段离心得到葡萄果皮上清液、葡萄籽上清液和葡萄籽沉淀；d）将所述葡萄果皮上清液、所述葡萄籽上清液和所述葡萄籽沉淀重悬混合后，进行第二阶段离心得到复合组织上清液；e）将所述复合组织上清液进行第三阶段离心去除上清液，得到葡萄复合组织外囊泡。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a）所述预处理的次数为两次以上；所述置于2~8℃的时间为2~16 h；所述置于0℃冰浴的时间为5~10 min；所述置于45~55℃的时间为10~30 min。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a）置于45~55℃具体为置于45~55℃的电热红外加热环境。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b）所述研磨的环境温度为8~24℃；所述研磨的总时间为2~12 min。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c）所述第一阶段离心的离心力为800~1200g；所述第一阶段离心的温度为20~30℃；所述第一阶段离心的时间为6~12min。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d）所述第二阶段离心为两步离心；第一步的离心力为800~1200 g，温度为20~25℃，时间为10~30 min；第二步的离心力为2600~3200 g，温度为20~25℃，时间为15~30 min。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e）所述第三阶段离心为两步离心；第一步的离心力为9000~11000 g，温度为20~25℃，时间为40~60 min；第二步的离心力为100000~110000 g，温度为4℃，时间为100~120 min。8.一种葡萄复合组织外囊泡，其特征在于，由权利要求1至7任意一项所述制备方法制得。9.一种可维持细胞活性的状态，改善细胞衰老的产品，其特征在于，包括权利要求8所述葡萄复合组织外囊泡。10.一种抗衰老制剂体系，其特征在于，包括基础培养基、fbs、l-glu、vegf、bfgf、igf-1、il-1β和权利要求8所述葡萄复合组织外囊泡；fbs的浓度为8~12%，l-glu的浓度为1~2%，vegf的浓度为20~50ng/ml，bfgf的浓度为1~4 ng/ml，igf-1的浓度为1~4 ng/ml，il-1β的浓度为0.5~2 ng/ml，所述葡萄复合组织外囊泡
的浓度为0.1~0.5 mg/ml。

技术总结

本发明属于细胞及分子生物学技术领域，尤其涉及一种葡萄复合组织外囊泡及其制备方法和应用。本发明葡萄复合组织外囊泡制备方法，通过把葡萄先后置于2~8℃、0℃冰浴和45~55℃的温度条件下进行连续切换式预处理，对果实不同组织分别研磨，以及不同组织的不同比例组合，再进行梯度离心，从而获得更大量外囊泡，更充分利用植物资源。该方法的制备过程不需添加任何化学试剂，操作简单可靠重复性好，污染可能性低，兼顾了成本经济性和操作安全性。结果表明本发明葡萄复合组织外囊泡对内皮祖细胞Nrf2信号通道有显著的调控效果，可用于改善皮肤组织（包括体表皮肤和消化道内表面）的细胞衰老状态和维持细胞活性，具有广阔的应用前景。景。景。