(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110163040.8
(22)申请日 2021.02.05
(71)申请人 四川省人民医院
地址 610072 四川省成都市青羊区一环路
西二段32号
(72)发明人 张侯斌 杨佳良 邹同丹
(74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人 刘妮
(51)Int.Cl.
G01N 1/28(2006.01)
G01N 1/30(2006.01)
G01N 1/36(2006.01)
G01N 1/42(2006.01)
G01N 1/06(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种制作眼冰冻切片的方法，包
洗，取出眼球，用吸水纸吸去多余的PBS，但维持
眼球表面湿润的状态；步骤2.用细小的棒状物蘸
中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，
使棒状物和角膜牢固粘贴在一起；步骤3.手持棒
状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心
管中，使整个巩膜浸入胶水中，但保持大部分角
膜在液面之上。步骤4.迅速让整个眼球浸入
1XPBS中，使胶水凝固。随后去除角膜和晶体，进
行固定、脱水、包埋、切片、染。本发明让广大研
究者在1小时左右得到一张质量形态好的冰冻切
片，其具备了简单、便捷、经济效果好的优点，将
会在眼科研究领域推广应用。权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 112781960 A 2021.05.11
C N 112781960
A
1.一种制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.取新鲜小鼠的眼球浸入1XPBS缓冲液中润洗，取出眼球，置于倒扣的培养皿上，用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态；
步骤2.用细小的棒状物蘸取少量502胶水，1‑5秒内将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，使棒状物和角膜牢固粘贴在一起；
步骤3.手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持整个角膜在液面之上；
步骤4.拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中；
步骤5.手拿棒状物，剪掉眼睛的角膜部分，用眼科显微镊去除晶体；
步骤6.放入4％多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟；
步骤7.放入30％蔗糖溶液中脱水30分钟；
步骤8.用吸水纸吸掉眼内的蔗糖溶液，把眼球置入灌满包埋液OCT的包埋盒内包埋；步骤9.将包埋样本放入‑80℃的冰箱，5‑10分钟后包埋液凝固。
2.根据权利要求1所述的制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，棒状物为10ul移液器用小头或者钝头的牙签或者网球拍用的尼龙弦。
3.根据权利要求1所述的制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，步骤3中，保证整个巩膜均匀地和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间1‑5秒。
4.根据权利要求1所述的制作眼冰冻切片的方法，其特征在于，步骤9还包括取出包埋好的组织块，用冰冻切片机切成10‑14um厚度的切片。 权 利 要 求 书1/1页CN 112781960 A
一种制作眼冰冻切片的方法
技术领域
[0001]本发明应用于眼科研究冰冻切片领域，尤其涉及一种制作用于免疫染的眼冰冻切片的方法。
背景技术
[0002](1)石蜡切片：是将组织通过一系列的处理后包埋于石蜡中，以达到保留组织较好的形态结构的切片方法，在组织化学中应用广泛，用于治病诊断及蛋白定位、表达水平等机制研究。其主要实验步骤有：制片、取材、固定(1小时到数天)、洗涤和脱水。通常从30％或50％酒精(1小时)、70％(1小时)、85％(1小时)、95％(1小时)直至无水乙醇(1小时)，透明(1‑2小时)、浸蜡(通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液中浸渍1‑2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点30℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内)、包埋。
[0003]整个石蜡切片的过程从切片至贴片、脱蜡(用二甲苯脱蜡，再逐级经酒精及梯度酒精直至蒸馏水)、染、脱水、透明、封片。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，且免疫染背景高。
[0004]石蜡切片存在的缺陷是：
[0005]操作步骤多，费时费力，免疫组化染非特异性背景强。其主要实验步骤有：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和贴片、脱蜡、染、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从
取材固定到封片制成玻片标本需要数日。在繁杂的操作过程中，抗原的免疫原性会丢失或者改变，导致免疫组化失败，或者免疫组化染的非特异性背景增强。
[0006](2)冰冻切片：是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便。
[0007]冰冻切片存在的缺陷是：
[0008]①组织结构形态不如石蜡切片清晰。
[0009]②不容易制作较薄的切片。
[0010]③组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位。
[0011]④不容易做连续切片。
[0012](3)眼组织切片，在眼科领域应用广泛，是研究疾病发生机制必不可少的实验方法。眼部组织，其结构精细，复杂，各组织结构所占体积不一，软硬程度不同所以要得到一张保持视网膜清晰完整结构的切片很难。无论冰冻切片还是石蜡切片都很难。
[0013]综上所述，在组织形态结构免疫组化大量在临床诊断和科研分析中大量应用的今天，迫切需要一种既可以兼具石蜡切片对组织形态的完整性的展示，又具有冰冻切片快速方便简单流程少，低染背景的方法。这种方法不仅节约大量的试剂耗材，也节约了实验人员宝贵的时间，缩短了实验周期，并且达到了更好的实验成像效果。
发明内容
[0014]本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种制作眼冰冻切片的方法。
[0015]本发明采用如下技术方案：
[0016]一种制作眼冰冻切片的方法，包括如下步骤：
[0017]1)取新鲜小鼠的眼球浸入1XPBS缓冲液中稍作润洗。取出眼球，置于倒扣的培养皿上。用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态。
[0018]2)用细小的棒状物(例如10ul移液器用小头或者钝头的牙签或者一小段网球拍用的尼龙弦)蘸取少量502胶水，迅速将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固。使棒状物和角膜牢固粘贴在一起。
[0019]3)手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持大部分角膜在液面之上。保证整个巩膜均匀和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间约1秒。
[0020]4)拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中(502胶水在遇水后迅速凝固，相当于给柔软变形的眼球组织穿上坚固的保护外壳，达到石蜡切片的形态效果)。
[0021]5)手拿棒状物，剪掉角膜，去除晶体。(棒状物解决了眼球操作过程中没有很好的夹取固定位置的问题。穿上502外衣的眼球在此时可以剪去角膜，取出晶体，而不会引起眼球结构的破坏，同时固定液可以更好的和视网膜接触，大大缩短了眼球固定和脱水的时间)。原来最少在冰上固定2小时，现在冰上固定30分钟即可。4％多聚甲醛溶液固定时间越短可以减少免疫组化染时的非特异背景，同时更好地保持抗原的免疫原性，最后得到更好的染效果。
[0022]6)放入4％多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟。
[0023]7)放入30％蔗糖溶液中脱水30分钟。
[0024]8)用吸水纸吸掉眼内的蔗糖溶液，把眼球置入灌满包埋液OCT的包埋盒内包埋。[0025]9)将包埋样本放入‑80℃的冰箱，约5分钟后包埋液凝固。去除包埋好的组织块，用冰冻切片机切成10‑14um厚度的切片。
[0026]本发明的有益效果：
[0027]1)用502胶水将棒状物和眼球角膜正中间粘合，解决眼球切片过程中，眼球光滑没有很好的固定抓取位点来进行操作的问题。
[0028]2)将502胶水与眼球整个巩膜均匀结合，并迅速放于PBS中，利用502胶水在遇水后迅速凝固并在眼球巩膜外形成相对坚固但不影响切片的保护膜的特性。解决了冰冻切片容易造成视网膜牵拉脱离，结构不齐，层次不清，严重影响视网膜层次结构及视网膜各组织抗原性的问题。
附图说明
[0029]图1为本发明的眼冰冻切片步骤流程示意图；
[0030]图2为1月小鼠视网膜石蜡切片HE染效果图；
[0031]图3为采用本发明方法的1月小鼠视网膜眼冰冻切片染效果图；
[0032]图4(a)、图4(b)、图4(c)为传统眼冰冻切片免疫组化染效果图；
[0033]图5(a)、图5(b)、图5(c)为用本发明方法的眼冰冻切片免疫组化染效果图。
具体实施方式
[0034]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]1)用502胶水将棒状物和眼球结膜正中间粘合，解决眼球切片过程中，眼球光滑没有很好的固定抓取位点来进行操作的问题。
[0036]2)将502胶水与眼球整个巩膜均匀结合，并迅速放于PBS中，利用502胶水在遇水后迅速凝固并在眼球巩膜外形成相对坚固但不影响切片的保护膜，避免了后续的剪去角膜，取晶体和包埋过程中眼球形变引起的网脱。解决另外冰冻切片容易造成视网膜牵拉脱离，结构不齐，层次不清，严重影响视网膜层次结构及视网膜各组织的抗原性的问题。[0037]3)给穿上保护膜的眼球去除角膜晶体后，再固定。既可以不损伤视网膜结构又可以让固定液和视网膜充分结合，缩短固定所需时间。节约时间。减少非特异性背景，提高染质量。解决了石蜡切片组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，且需要大量的试剂盒繁琐的操作步骤的实验技术弊端。
[0038]4)简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。
快速、用时短。组织变化不大。能很好保存脂肪，类脂等成分。能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
[0039]如图1、图3所示，本发明的一种制作眼冰冻切片的方法，包括如下步骤：
[0040]1)取新鲜动物眼球浸入1XPBS缓冲液中稍作润洗。取出眼球，置于倒扣的培养皿上。用吸水纸吸去多余的PBS，但维持眼球表面湿润的状态。
[0041]2)用细小的棒状物(例如10ul小头或者钝头的牙签)蘸取少量502胶水，1‑5秒内将棒状物对准眼球角膜正中间位置，502胶水遇到湿润的角膜，迅速凝固，使棒状物和角膜牢固粘贴在一起。
[0042]3)手持棒状物将眼球放于装有502胶水的200微升的离心管中，使整个巩膜部分浸入胶水中，但保持整个角膜在液面之上。保证整个巩膜均匀和502胶水接触，巩膜与502胶水的接触时间约1‑5秒。
[0043]4)拿出眼球，并迅速让整个眼球浸入PBS中(502胶水在遇水后迅速凝固，相当于给柔软变形的眼球组织穿上坚固的保护外壳，达到石蜡切片的形态效果)。
[0044]5)手拿棒状物，剪掉角膜，用眼科显微镊小心去除晶体。(棒状物解决了眼球操作过程中没有很好的夹取固定位置的问题。穿上502胶水外衣的眼球在此时可以剪去角膜，取出晶体，而不会引起眼球结构的破坏，同时固定液可以更好的和视网膜接触，大大缩短了眼球固定和脱水的时间)。原来在冰上
的固定时间是2小时，现在减少到30分钟。4％多聚甲醛溶液固定时间越短可以减少免疫组化染时的非特异背景，同时更好地保持抗原的免疫原性，最后得到更好的染效果。
[0045]6)放入4％多聚甲醛溶液中，冰上固定30分钟。
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