(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210017259.1
(22)申请日 2022.01.07
(71)申请人 重庆嘉士腾生物科技有限公司
地址 401120 重庆市两江新区大竹林街道
金开大道西段210号3楼3号附21-03-
001343号
(72)发明人 黄璘 聂盼 万源
(74)专利代理机构 重庆航图知识产权代理事务
所(普通合伙) 50247
代理人 王贵君
(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)
C12N 5/071(2010.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用(57)摘要本发明公开了一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用，属于生物医药技术领域，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R ‑Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh ‑EGF、P DG F 、N og g i n 、A 83‑01、W n t 3a 、Y ‑27632、S B 202190、B27、N ‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，所述培养基用于建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官，可以加快乳腺或/和乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建 立的成功率。权利要求书1页 说明书6页 附图8页CN 114317442 A 2022.04.12
C N 114317442
A
1.一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R ‑Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、
FGF10、rh ‑EGF、PDGF、Noggin、
A83‑01、Wnt3a、Y ‑27632、SB202190、B27、N ‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
2.根据权利要求1所述建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述组分的浓度如下：雌二醇10nM ‑1000nM、氢化可的松0.1‑100μg/ml、R ‑Spondin 3100‑500ng/ml、Neuregulin 1 1‑10nM、FGF7 1‑10ng/ml、FGF10 10‑100ng/ml、rh ‑EGF 1‑10ng/ml、PDGF 1‑10ng/ml、Noggin 50‑500ng/ml、A83‑01 100‑1000nM、Wnt3a 1‑5nM、Y ‑27632 1‑10μM、SB202190 100‑1000ng、B27 10ng/ml、N ‑乙酰半胱氨酸1‑5nM、烟酰胺1‑10nM、GlutaMax 1‑5nM、胎牛血清体积分数10％、青霉素/链霉素双抗体积分数1％。
3.基于权利要求1或2所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步
骤：
(1)将获得的乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液；
(2)将步骤(1)制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入权利要求1或2所述的培养基，培养箱中扩大培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织的来源于哺乳动物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述剪碎后组织大小为1cm ×1cm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，扩大培养中每三天更换一次培养基。
9.权利要求1或2任一项所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物或方案中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物及方案包含化疗药物和靶向药物、放疗。
权 利 要 求 书1/1页CN 114317442 A
一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和
应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用。
背景技术
[0002]乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象。疾病早期常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状，晚期可因癌细胞发生远处转移，出现多器官病变，直接威胁患者的生命。乳腺癌常被称为“粉红杀手”，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位，男性乳腺癌较为少见。目前抗乳腺癌的药物水平不均衡，有效的药物十分昂贵且效果不太理想，药物筛选水平层次不齐，缺乏一个能够高度模拟体内微环境的评估系统，类器官培养越来越多地用于实验模拟人类癌症，
以期定制个性化药物和预测药物反应。乳腺癌也不例外，但原发性乳腺癌尤其存在一些固有的困难，活检中经常存在残留的非恶性细胞，近来，类器官技术已被用于生成大量乳腺癌类器官，相较于2D的细胞培养，类器官的三维培养更能体现肿瘤组织在体内的生长环境，不管在结构、还是亚细胞种类都高度还原了肿瘤器官的原生态。
[0003]类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补，是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵监测信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。[0004]类器官在抗肿瘤药物筛选领域表现出了巨大的潜力，药物的筛选测试展示了药物对类器官最直观的表现，高度模拟了药物对器官的效果。因此，亟需一种可以加快乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率的培养方法，为乳腺癌类器官的培养提供了多样性。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基；本发明的目的之二在于基于所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法；本发明的目的之三在于提供所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物中的应用。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]1、一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基
[0008]所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R‑Spondin3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh‑EGF、PDGF、Noggin、A83‑01、Wnt3a、Y‑27632、SB202190、B27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。[0009]本发明优选的，所述组分的浓度如下：雌二醇10nM‑1000nM、氢化可的松0.1‑100μg/ml、R‑Spondin 3 100‑500ng/ml、Neuregulin 1 1‑10nM、FGF7 1‑10ng/ml、FGF10 10‑100ng/ml、rh‑EGF1‑10ng/ml、PDGF 1‑10ng/ml、Noggin 50‑500ng/ml、A83‑01 100‑1000nM、Wnt3a 1‑5nM、Y‑276321‑10μM、SB202190 100‑1000ng、B27 10ng/ml、N‑乙酰半胱氨酸1‑5nM、烟酰胺1‑10nM、GlutaMax 1‑5nM、胎牛血清体积分数10％、青霉素/链霉素双抗体积分数1％。
[0010]2、基于权利要求1或2所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法，包括以下步骤：
[0011](1)将获得的乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液；
[0012](2)将步骤(1)制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入权利要求1或2所述的培养基，培养箱中扩大培养。
[0013]本发明优选的，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织的来源于哺乳动物。[0014]本发明优选的，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
[0015]本发明进一步优选的，步骤(1)中，所述剪碎后组织大小为1cm×1cm。
[0016]本发明进一步优选的，步骤(1)中，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
[0017]本发明优选的，步骤(2)中，扩大培养中每三天更换一次培养基。
[0018]3、所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物中的应用。[0019]本发明优选的，所述药物包含化疗药物、放疗或/和靶向药物。
[0020]本发明的有益效果在于：本发明公开了一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R‑Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh‑EGF、PDGF、Noggin、A83‑01、Wnt3a、Y‑27632、SB202190、B27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，所述培养
基用于建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官，可以加快乳腺或/和乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，提高类器官的建立以及提高类器官建立的成功率。
附图说明
[0021]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0022]图1为配方1‑3的培养基培养乳腺癌类器官14天生长形态图(100倍)；
[0023]图2为配方1‑3的培养基培养乳腺癌类器官培养14天的生长曲线图；
[0024]图3为对比配方1不含重要生长因子PDGF的培养基培养乳腺癌类器官14天生长形态图(100倍)；
[0025]图4为对比配方1不含重要生长因子PDGF的培养基培养乳腺癌类器官14天的生长曲线图；
[0026]图5为对比配方2不含重要生长因子Wnt3a、FGF 7、FGF 10、PDGF、rh‑EGF的培养基
培养乳腺癌类器官14天的生长形态图；
[0027]图6为对比配方2不含重要生长因子Wnt3a、FGF 7、FGF 10、PDGF、rh‑EGF的培养基培养乳腺癌类器官14天的生长曲线图；
[0028]图7为配方1‑3的培养基培养乳腺类器官的3天、5天、10天的生长形态图(100倍)；[0029]图8为配方1‑3的培养基培养乳腺癌类器官的第14天HE染图(400倍)；
[0030]图9为乳腺癌类器官筛选抗肿瘤药物的CCK‑8肿瘤抑制率图；
具体实施方式
[0031]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0032]本发明实施例中涉及的培养基组分雌二醇(β‑estradiol)，购自Sigma公司、氢化可的松(hydrocortisone)，购自Sigma公司、R‑Spondin 3，购自R&D公司；Neuregulin 1，购自Peprotech公司；FGF7，购自Peprotech公司；FGF10，购自Peprotech公司；rh‑EGF，购自Peprotech公司；PDGF，购自Peprotech公司；Noggin，购自Peprotech公司；A83‑01，购自Tocris公司；Wnt3a，购自Gibco公司；Y‑27632，购自Abmole公司；SB202190，购自Sigma公司；B27，购自Gibco公司；N‑Acetylcysteine，购自Gibco公司；Nicotinamide，购自Sigma公司；GlutaMax，购自Sigma公司；FBS，购自Gibco公司；Penicillin/Streptomycin，购自Gibco公司；DMEM/F12，购自Gibco公司。
[0033]实施例1、建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基
[0034]按下述浓度将各组分加入到DMEM/F12培养基中，得到用于培养乳腺癌类器官的培养基A：
[0035]配方1：雌二醇100nM，氢化可的松50μg/ml、R‑Spondin 3(250ng/ml)、Neuregulin 1(5nM)、FGF7(5ng/ml)、FGF10(50ng/ml)、rh‑EGF(5ng/ml)、PDGF(血小板衍生生长因子，5ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、A83‑01(TGF‑βI型受体抑制剂，500nM)、Wnt3a(5nM)、Y‑27632 (蛋白激酶p160ROCK抑制剂，5μM)、SB202190(p38 MAPK抑制剂，500ng)、B27(10ng/ml)、N‑乙酰半胱氨酸(N‑Acetylcysteine，5nM)、烟酰胺(Nicotinamide，10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10％)、青链霉素(Penicillin/Streptomycin，1％)。
[0036]配方2：雌二醇10nM，氢化可的松0.1μg/ml、R‑Spondin 3(100ng/ml)、Neuregulin 1(1nM)、FGF7(1ng/ml)、FGF10(10ng/ml)、rh‑EGF(1ng/ml)、PDGF(1ng/ml)、Noggin(50ng/ ml)、A83‑01(100nM)、Wnt3a(1nM)、Y‑27632(1μM)、SB202190(100ng)、B27(10ng/ml)、N‑Acetylcysteine(1nM)、Nicotinamide(1nM)、GlutaMax添加剂(1nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)。
[0037]配方3：雌二醇1000nM，氢化可的松100μg/ml、R‑Spondin 3(500ng/ml)、Neuregulin1(10nM)、FGF7(10ng/ml)、FGF10(100ng/ml)、rh‑EGF(10ng/ml)、PDGF(10ng/ ml)、Noggin(500ng/ml)、A83‑01(1000nM)、Wnt3a(5nM)、Y‑27632(10μM)、SB202190 (1000ng)、B27(1
0ng/ml)、N‑Acetylcysteine(5nM)、Nicotinamide(10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)。
[0038]对比配方1：与上述配方区别是培养基中不含生长因子PDGF，各组分具体含量如下：R‑Spondin 3(250ng/ml)、Neuregulin 1(5nM)、FGF 7(5ng/ml)、FGF 10(50ng/ml)、rh‑
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