(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610651378.7
(22)申请日 2016.08.10
(83)生物保藏信息
CGMCC No. 12602 2016.06.07
(71)申请人 洛阳华荣生物技术有限公司
地址 471000 河南省洛阳市西工区洛阳工
业园区秦岭北路11号
(72)发明人 范文超
(74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280
代理人 贾师英
(51)Int.Cl.
C12P 39/00(2006.01)
C12P 13/00(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/15(2006.01)
C12R 1/125(2006.01)C12R 1/13(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种通过微生物发酵生产肌
酵直接将碳源和氮源转化为肌酸，
所生产的肌酸达到营养补充剂的标准，具有广阔的工业应用前
景。上述方法中使用的微生物包括通过基因工程
种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为
CGMCC No.
12602。权利要求书1页 说明书5页CN 106065411 A 2016.11.02
C N 106065411
A
1.一种生产肌酸的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为肌酸，所述微生物中产生的肌酸被排出到发酵液中，从发酵液中回收肌酸，所生产的肌酸达到营养补充剂的标准，
所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：将葡萄糖转化为谷氨酸；将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸；将N-乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛；将N-乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸；将N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸；将鸟氨酸转化为瓜氨酸；将瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；将精氨基琥珀酸转化为精氨酸；将精氨酸转化为胍基乙酸；将胍基乙酸转化为肌酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：N-乙酰谷氨酸合成酶、N-乙酰鸟氨酸-δ-转氨酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶、精氨酸琥珀酸酶、甘氨酸转氨酶、胍基乙酸N-甲基转移酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达甘氨酸转氨酶和胍基乙酸N-甲基转移酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12602。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮源选自有机氮源和无机氮源，所述有机氮源选自玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液、酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和尿素；所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、或氨水。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH 4)2SO 4 20g/L、KH 2PO 4 1.5g/L、MgSO 4·7H 2O 0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、甘氨酸50g/L、生物素100μg/L，消泡剂0.2g/L。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中添加有甘氨酸 50g/L。
9.通过权利要求1-8中任一项所述方法制备的肌酸，其不含细菌内毒素，符合中国关于食用肌酸的轻工行业标准QB/T 2834-2006。
10.一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12602。
权 利 要 求 书1/1页CN 106065411 A
发酵法生产肌酸
技术领域
[0001]本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种通过微生物发酵生产肌酸的方法。
背景技术
[0002]肌酸(Creatine)化学名称为N-甲基胍乙酸，又称为胍基醋酸、肌肉素、肌氨基酸、甲胍基醋酸等，是脊椎动物体内自然产生的一种氨基酸衍生物，是存在于人体中的天然营养素，人体中的肌酸是由精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸在肝、肾、胰脏中合成经由血液输送到肌肉组织，并以磷酸肌酸盐的形式贮存于肌肉组织。肌酸对促进核酸、蛋白质的合成，增加体内能量物质的储备，促进肌肉的生长，以及延缓疲劳和加速体能恢复具有重要的作用。肌酸是当前使用最广的运动营养补剂，其作为一种运动营养物质，可显著提高肌肉力量和肌体的持久力，具有抗疲劳、促恢复的功效，是运动营养补剂中的常青树。由于肌酸不属于激素类物质，其不会产生耐药性和生理性副反应，因而肌酸营养制剂备受
人们亲睐，国内外对肌酸的生产及应用都予以足够的重视。
[0003]目前，肌酸主要通过化学合成方法获得，合成肌酸的路线主要有以下几种：1.与肌氨酸钠水溶液反应直接生成肌酸；2.与用干燥的氯化氢气体饱和了的甲醇溶液反应得O-甲基异脲盐酸盐，O-甲基异脲盐酸盐再和肌氨酸反应得到肌酸；3.和盐酸水溶液在通入空气的条件下生成氯代甲脒氯化物，然后和肌氨酸钠反应得到肌酸；4.氨基氰与、甲胺反应得到一水肌酸；5.以硫脲和硫酸二甲酯为原料生成S-甲基异硫脲硫酸盐，S-甲基异硫脲硫酸盐再和肌氨酸、肌氨酸钠或肌氨酸钾反应得到肌酸；6.尿素和硫酸二甲酯反应得到O-甲基异脲硫酸甲酯，不用进一步纯化，再和肌氨酸钠反应得到肌酸。上述反应方式的反应时间长，操作工艺复杂，且产品纯度也不是很高。这些传统的制备方法中往往涉及剧毒的氰胺或者收率不够理想，从而具有极大的安全隐患和生产成本高的弊端，尤其对于大规模工业化生产中，剧毒物质的泄漏很容易造成人员伤亡，同时也不贴合绿环保的潮流。
[0004]通过化学合成方法生产的肌酸一般都带有异味比如苦味，不能直接用作食品添加剂，往往需要用硫代硫酸钠等脱苦味剂来处理，后处理工艺复杂，收率仅为50％左右。[0005]目前，人们普遍认为天然或生物来源的化合物更安全，对于食品成分包括食品添加剂的来源越来越追求“天然化”。出于市场推广目的，食品和饮料生产商都更乐意使用生物来源的产品来替代化学方法合成出来的相同物质。肌酸作为广泛使用的食品添加剂，寻一种生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。
发明内容
[0006]为了实现生物方法来生产食品级的“安全无毒”的肌酸，发明人对于微生物一步发酵法进行了探索，选择无致病性的微生物作为宿主，利用基因工程技术进行改造，通过增强与肌酸产生相关的基因的表达，弱化分支代谢途径，筛选出高产肌酸的生产菌株。这几种肌酸生产菌在发酵过程中能有效地积累肌酸，具有广阔的工业化应用前景。
[0007]因此，本发明的第一个目的在于提供一种生产肌酸的方法。
[0008]本发明的第二个目的在于提供一种食品级的肌酸。
[0009]本发明的第三个目的在于提供一种肌酸生产菌。
[0010]本发明包括如下技术方案：
[0011]一种生产肌酸的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为肌酸，所述微生物中产生的肌酸被排出到发酵液中，从发酵液中回收肌酸，
[0012]所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：将葡萄糖转化为谷氨酸；将谷氨酸
转化为N-乙酰谷氨酸；将N-乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛；将N-乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸；将N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸；将鸟氨酸转化为瓜氨酸；将瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；将精氨基琥珀酸转化为精氨酸；将精氨酸转化为胍基乙酸；将胍基乙酸转化为肌酸。
[0013]优选地，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthase)、N-乙酰鸟氨酸-δ-转氨酶(N-acetylornithine-δ-aminothransferase)、N-乙酰鸟氨酸酶(N-acetylornithinase)、鸟氨酸甲氨酰转移酶(ornithine ca rbamoyl thra nsf erase)、精氨酸琥珀酸酶(a rg inosuccina te synthetase)、甘氨酸转氨酶(glycine amidinotransferase，EC:2.1.4.1)、胍基乙酸N-甲基转移酶(guanidinoacetate N-methyltransferase，EC:2.1.1.2)。
[0014]更优选所述微生物过表达甘氨酸转氨酶和胍基乙酸N-甲基转移酶。
[0015]在优选的实施方式中，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12602。
[0016]肌酸是一种氨基酸，在水中具有等电点，因此可通过等电点法和/或离子交换法从发酵液中提取肌酸。可选地，可以进一步通过在水中重结晶方法纯化肌酸。
[0017]发酵过程中，对于不同的微生物，可采用不同的培养基，其中所述碳源可以选自葡萄糖、蔗糖
、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。发酵培养基中的氮源可以选自有机氮源和无机氮源，所述有机氮源选自玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液、酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和尿素；所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、或氨水。
[0018]根据本发明的优选实施例，当微生物采用谷氨酸棒杆菌时，发酵培养基组成如下：葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH4)2SO4 20g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、甘氨酸50g/L、生物素100μg/L，消泡剂0.2g/L。[0019]优选地，当发酵过程中进行补料，即采取分批补料培养方式时，所使用的补料培养基组成如下：硫酸铵500g/L、葡萄糖650g/L。
[0020]在优选的实施方式中，发酵培养基中可以添加有50g/L的甘氨酸。
[0021]通过本发明的方法制备的肌酸，不含细菌内毒素，也不包含有毒害性的化学物质，符合中国关于食用肌酸的轻工行业标准QB/T 2834-2006，满足用于肌酸的FDA标准，因此可以保障其食品安全性。另外，由于不含化学残留物或化学反应杂质，本发明的肌酸不含化学异味比如苦味，可以直接用于制作食品或饮料。并且将其命名为“Creaferm”。
[0022]可选地，本发明的肌酸呈一水合物形式即一水肌酸，其中一个肌酸分子包含一个结晶水，为白粉末。
[0023]一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12602。
[0024]本发明所构建的肌酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中肌酸的有效积累，得到食品级的肌酸，因而具有广阔的工业应用前景。
[0025]本发明构建的肌酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacterium glutamicum，中文名称是谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒状杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2016年6月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12602。
具体实施方式
[0026]以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0027]本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
[0028]本发明的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。
[0029]在本文中，对于本发明，术语“肌酸基因工程生产菌”、“肌酸生产菌”、“肌酸基因工程菌”表示相同的意义，都是指发明人构建的用于发酵生产肌酸的微生物。
[0030]在本发明中，术语“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒状杆菌”、“菌株CGMCC No.12602”、“谷氨酸棒(状)杆菌HR056”表示相同的意义，都是指发明人构建的用于发酵生产肌酸的菌株。
[0031]美国食品和药品监督管理局FDA和中国政府对于作为食品添加剂肌酸有严格的规定，比如，FDA已对用于食品、药物和化妆品的肌酸制定了标准。此外，仅“安全的”有机溶剂可用于肌酸的合成，并且这些溶剂的残留量应被控制到符合标准。
[0032]中国国家发展和改革委员会于2006年12月17日发布了食用肌酸的轻工行业标准QB/T 2834-2006。该标准规定：食用肌酸中的一水合物(一水肌酸，Creatine Monohydrate)的质量分数不低于99.0％，无异味，铅含量不高于0.5(mg/kg)，无机砷含量不高于0.25(mg/ kg)，不含致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄葡萄球菌、溶血性链球菌)。
[0033]为了满足肌酸的FDA标准和中国的QB/T 2834-2006标准，并且满足消费者以及食品和饮料生产商对于食品添加剂肌酸“天然化”或“生物化”来源的追求，发明人研究了用微生物发酵来生产肌酸的方法。发明人对于用于构建基因工程菌株的微生物品种进行了筛选，摒弃了虽然常用、但有潜在致病性的微生物比如大肠肝菌，选择无致病性的谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆
菌、黄短杆菌和产氨短杆菌等作为宿主，构建了基因工程菌，通过筛选，得到可通过一步发酵生产肌酸的几种菌株。这些菌株在发酵过程中不会产生可能对于大部分人造成危害的内毒素，符合“无毒无害”的设计思想。[0034]作为一种优选的实施方式，本发明的菌株还能够过表达一种以上选自下组的酶： N-乙酰谷氨酰胺酶(N-acetylglutamokinase)、N-乙酰谷氨酸酸-γ-半醛脱氢酶(N-a c e t y l g l u ta m a t e-γ-s e m i a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e)、精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinase)。
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