[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1634598A [43]公开日2005年7月6日
[21]申请号200410066775.5[22]申请日2004.09.29
[21]申请号200410066775.5
[71]申请人中国人民解放军第二军医大学
地址200433上海市杨浦区翔殷路800号
[72]发明人胡晋红 刘继勇 朱全刚 孙华君 [74]专利代理机构上海新天专利代理有限公司代理人丁振英
[51]Int.CI 7A61K 49/00
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉
机理的动物模型构建方法。通过BALB/c小鼠尾静脉
注射anti－DNP IgE单克隆抗体致敏，以2，4二硝
基氟苯作为抗原进行激发，构建小鼠皮肤过敏模型。
故可用于皮肤过敏药物的筛选及皮肤过敏发病机制
和药物作用机理的研究，具有方法简单，造模周期
短，重现性好等优点。
200410066775.5权 利 要 求 书第1/1页
1.一种小鼠皮肤过敏动物模型的构建方法，包括用致敏原致敏和用抗原激发，其特征在于所用动物为BALB/c种小鼠，6-8周龄，SPF级，雌性；致敏原为anti-DNP IgE单克隆抗体；抗原为2，4二硝基氟苯，构建方法为：将anti-DNP IgE单克隆抗体以pH7.4
磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1∶5000-1∶10000，尾静脉注射于BALB/c小鼠，剂量为0.5-1ml；注射后24h小鼠两耳分别均匀涂以50μl 0.1-0.2％2，4二硝基氟苯溶液进行激发即可。
200410066775.5说 明 书第1/4页
一种小鼠皮肤过敏动物模型的构建方法
技术领域
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种用于筛选皮肤过敏药物，研究皮肤过敏机理的动物模型构建方法。
背景技术
皮肤过敏是由致敏原刺激机体引起的抗原-抗体反应。当外界致敏原进入机体时，激活T淋巴系统和B淋巴系统，诱导肥大细胞脱颗粒，释放组胺、缓激肽等过敏炎症介质，产生过敏反应，常表现为皮肤过敏等症状。近年来由于环境污染的加重、化学品的滥用，外界有害物质刺激增多，皮肤过敏的发生率呈逐年上升趋势。该病虽对生命安全无直接威胁，但因病因复杂，迁延难治，发病率高，严重影响了患者的生活质量。 过敏性疾病的发病机制尚不完全清楚，对皮肤过敏的药物还局限在激素及传统的抗组胺药物上，特别是皮肤过敏的动物模型还一直停留在传统的大鼠同种被动皮肤过敏反应、小鼠被动皮肤过敏发应、小鼠耳异种被动皮肤过敏反应等模型上，这些模型采用卵白蛋白或注射用天花粉作为抗原，以百日咳疫苗或氢氧化铝凝胶作为致敏原，首先要先将动物致敏制备抗血清，然后再进行被动皮肤致敏，激发，进行造模，所需周期长，模型制备复杂，且成模率不高，对个别药物还存在假阴性反应。评价指标主观性较大，难以全面反应皮肤过敏发病过程。这严重制约了研究人员大规模
筛选皮肤过敏药物、深入研究皮肤过敏的发病机制和药物的作用机理。
IgE是介导皮肤过敏反应的重要介质，与组织细胞具有较强的亲和力，当IgE抗体进入体内后，IgE的Fc端与皮肤的肥大细胞表面的特异性受体结合，形成IgE复合物，使肥大细胞致敏。当受到抗原攻击时，抗原与肥大细胞表面上IgE的另一端Fab端结合，导致IgE分子构型的改变，引起过敏反应的发生。皮肤过敏反应常表现为荨麻疹、瘙痒、水肿等症状。以IgE作为致敏原，可以较容易的造成皮肤过敏反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小鼠皮肤过敏模型的构建方法。
本发明小鼠皮肤过敏模型的构建方法，是以anti-DNP IgE单克隆抗体做为致敏原，尾静脉注射于BALB/c小鼠，使小鼠致敏，再以2，4二硝基氟苯作为抗原进行激发实现的。
构建模型所需的动物及试剂为：动物选用B A L B/c小鼠，6-8周龄，S P F级，雌性；抗体为Sigma公司提供的anti-DNP IgE单克隆抗体，使用时以pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1∶5000-1∶10000；抗原为2，4二硝基氟苯溶液，浓度为0.1-0.2％，溶剂为丙酮∶橄榄油＝3∶1。
模型的构建方法为：(1)致敏：BALB/c小鼠尾静脉注射0.5-1ml anti-DNP IgE单克隆抗体；(2)激发：注
射后24h小鼠两耳分别均匀涂以50μl二硝基氟苯溶液进行激发。于激发后1h、12h、24h、2日、3日、…10日以测厚仪分别测定小鼠双侧耳的肿胀度，以此作为过敏反应程度的指标。在激发后1h、24h、7日分别取下小鼠耳朵，10％福尔马林固定，进行病理组织学检察，检察指标为耳朵水肿程度，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目的增多，以及淋巴细胞浸润等情况。
本发明的造模方法，BALB/c小鼠在激发后耳肿胀程度在1h、24h、7日分别出现三个峰值，称为三相反应，即速发相、迟发相和超迟发相反应。病理检查结果表明，小鼠皮肤在激发后24h，出现水肿、炎性细胞浸润等现象；在激发后第7天，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目明显增多，水肿程度进一步增强，同时可见表皮的增生。这些现象与人类皮肤过敏的病理过程相符，表明该模型可较好地模拟皮肤过敏动态反应的全过程，故可用于皮肤过敏药物的筛选，研究皮肤过敏的发病机制和药物的作用机理。 本发明与传统的皮肤过敏模型相比，可较好地模拟皮肤过敏动态反应的全过程，且克服了传统造模方法需要预先制备抗血清、周期长、成模率不高等缺点，具有方法简单、周期短、重现性好等优点。
附图说明
图1为小鼠造模激发后耳肿胀度与时间的时效曲线图。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明动物模型构建方法及抗过敏药物对模型动物的效果作详细描述。
实施例1
1.实验动物与材料：
BALB/c小鼠，(6周龄，SPF级，雌性)，购自中科院上海实验动物中心，动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003。
抗体：anti-DNP IgE单克隆抗体(Sigma公司)，使用时以pH7.4PBS稀释至1∶5000。 抗原：0.15％2，4二硝基氟苯溶液，溶剂为丙酮∶橄榄油＝3∶1。 药物：盐酸西替利嗪(江苏联科制药厂)，大剂量组药物浓度为1mg/ml，小剂量组药物浓度为0.1mg/ml。
2.实验方法：B A L B/c小鼠60只，激发前24h以测厚仪测定两耳的厚度，作为基础值。将小鼠随机分为4组，分别为正常对照组6只，模型组、盐酸西替利嗪大剂量组(10mg·kg-1)、盐酸西替利嗪小剂量组(1mg·kg-1)各18只。正常对照组在实验过程中按常规饲养，其余各组每只小鼠尾静脉注射0.5ml anti-DNP IgE单克隆抗体致敏，药物组于激发前1h及激发后第2天起每日灌胃给药0.2mL，模型组则给予等体积的生理盐水。注射后24h小鼠两耳分别涂以50μl二硝基氟苯溶液进行激发。模型组及药物组于激发后1h、24h、7d分别测定小鼠耳厚度后，各处死6只，取下小鼠双耳，10％福尔马林固定，HE染，进行病理组织学检测，观察过敏反应不同阶段皮肤组织的病理变化，检查指标为耳朵水肿程度，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目的增多，以及淋巴细胞浸润等情况。
3.实验结果：如图1所示，模型组小鼠在激发后1h和24h分别出现速发相反应(IPR)
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