(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811162706.2
(22)申请日 2018.09.30
(71)申请人 杭州华安单抗生物技术有限公司
地址 310000 浙江省杭州市江干区杭州经
济技术开发区白杨街道6号大街452号
2幢D1601-1609号房
(72)发明人 戴继鸿 詹梦黎
(74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理
事务所(普通合伙) 11371
代理人 李青
(51)Int.Cl.
C12N 5/0781(2010.01)
C12N 5/10(2006.01)
C07K 16/00(2006.01)
(54)发明名称兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用(57)摘要本发明提供了一种兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用，涉及生物技术领域。该培养体系包括饲养细胞、IL -4、IL -10、IL -21、丝裂原和基础培养基；其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD 40L的细胞。稳定表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞，CD40L和CD40结合后，可以促进B细胞的生产增殖；IL -4、IL -10、IL -21和丝裂原的协同作用下可以进一步的促进B细胞的增殖和抗体的产生。该兔外周血B 细胞的培养方法使用上述培养体系培养即可，可实现B细胞的体外培养。该抗体的制备方法包括使用上述培养体系培养能够产生抗体的兔外周血B细胞，可以持续的促进B细胞增殖并分泌抗
体。
权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图4页CN 109234232 A 2019.01.18
C N 109234232
A
1.一种兔外周血B细胞的培养体系，其特征在于，包括：饲养细胞、IL -4、IL -10、IL -21、丝裂原和基础培养基；
其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的细胞。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的RK -13细胞；
优选地，所述饲养细胞包括保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株。
3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述IL -4的终浓度为10-25ng/mL；所述IL -10的终浓度为5-20ng/mL；所述IL -21的终浓度为5-20ng/mL；
优选地，所述IL -4的终浓度为15-25ng/mL；所述IL -10的终浓度为8-15ng/mL；所述IL -21的终浓度为8-15ng/mL；
更优选地，所述IL -4的终浓度为20ng/mL；所述IL -10的终浓度为10ng/mL；所述IL -21的终浓度为10ng/mL。
4.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于，IL -4、IL -10和IL -21为兔源的白细胞介素。
5.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述丝裂原包括脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白A中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原；
优选地，所述美洲商陆丝裂原的终浓度为5-10μg/mL；优选为5.5-9μg/mL；更优选为6-8μg/mL。
6.一种兔外周血B细胞的培养方法，其特征在于，包括：使用权利要求1-5中任一项所述的培养体系培养兔外周血B细胞。
7.一种兔抗体的制备方法，其特征在于，包括：使用权利要求1-5中任一项所述的培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，使用抗原体外免疫兔外周血B细胞，得到表达抗体的兔外周血B细胞，再使用所述培养体系培养。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将分离出的兔外周血淋巴细胞在包被有特异性抗原的培养容器中孵育；孵育完毕后消化贴壁细胞，得到抗原特异性的B细胞；
重悬后置于含有所述饲养细胞的培养容器内，然后加入IL -4、IL -10、IL -21和丝裂原进行体外培养。
10.权利要求1-5中任一项所述的培养体系、权利要求6所述的培养方法或权利要求7-9中任一项所述的抗体的制备方法的应用，其特征在于，所述应用包含如下(x1)-(x5)中的一种或多种：
(x1)制备兔源单克隆和/或多克隆抗体；
(x2)制备抗体药物；
(x3)构建兔源免疫模型；
(x4)构建噬菌体库；(x5)高通量测序。
权 利 要 求 书1/1页CN 109234232 A
兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和
应用
技术领域
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种兔外周血B细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用。
背景技术
[0002]1975年，Dr.Kohler和Dr.Milstein证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术称为杂交瘤技术。该技术的主要原理是将能在体外无限繁殖但不能合成分泌抗体的骨髓瘤细胞与在体外不能无限繁殖但能合成分泌抗体的免疫脾细胞融合在一起，成为一株既能无限增殖又能不断分泌抗体的杂交瘤细胞。该技术发明并成功运用在科学研究，临床诊断，药物开发等多个领域，成为科研人员运用抗体产生的最主要的方法。
[0003]1995年，Dr.Katherine Knight在Loyola University of Chicago成功地在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。在21世纪初，Dr.Robert Pytela和Mr.Weimin Zhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。Epitomics公司(Abcam公司)独家拥有兔单克隆抗体技术的专利，并且开发了兔单克隆抗体用于科研、诊断和的许可平台。
[0004]小鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体，都被广泛的应用于科研、诊断、试剂盒制备、快诊、药物研发等多个领域。尤其在科研和诊断领域，兔单克隆抗体由于其高特异性，高亲和力，多位点识别，而且能识别差异很小的不同蛋白结构，越来越被人们使用。
[0005]随着分子生物学的不断发展，现在产生兔单克隆抗体的方法也越来越多。传统的杂交瘤技术目前还在Abcam的专利保护期内，因此市场上需要一种改进的生产兔源抗体的方法以满足市场的需要。
[0006]有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007]本发明的第一目的在于提供一种兔外周血B细胞的培养体系，该培养体系以能够表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞，能够高效的在体外培养B细胞。
[0008]本发明的第二目的在于提供一种兔外周血B细胞的培养方法，该方法使用上述兔外周血B细胞的
培养体系培养兔外周血B细胞。
[0009]本发明的第三目的在于提供一种抗体的制备方法，该方法使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。
[0010]本发明的第四目的在于提供上述兔外周血B细胞的培养体系、上述兔外周血B细胞的培养方法或上述抗体的制备方法的应用。
[0011]为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
[0012]一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基
础培养基；其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的细胞。
[0013]优选地，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的RK-13细胞；
[0014]优选地，所述饲养细胞包括保藏号为CCTCC NO：C2018180的细胞株。
[0015]优选地，所述IL-4的终浓度为10-25ng/mL；所述IL-10的终浓度为5-20ng/mL；所述IL-21的终浓度为5-20ng/mL；
[0016]更优选地，所述IL-4的终浓度为15-25ng/mL；所述IL-10的终浓度为8-15ng/mL；所述IL-21的终浓度为8-15ng/mL；
[0017]进一步优选地，所述IL-4的终浓度为20ng/mL；所述IL-10的终浓度为10ng/mL；所述IL-21的终浓度为10ng/mL。
[0018]优选地，IL-4、IL-10和IL-21为兔源的白细胞介素。
[0019]优选地，所述丝裂原包括脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白A中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原；
[0020]优选地，所述美洲商陆丝裂原的终浓度为5-10μg/mL；优选为5.5-9μg/mL；更优选为6-8μg/mL。
[0021]本发明还提供了一种兔外周血B细胞的培养方法，包括使用上述培养体系培养兔外周血B细胞。
[0022]本发明还提供了一种兔抗体的制备方法，包括：使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。
[0023]优选地，使用抗原体外免疫兔外周血B细胞，得到表达抗体的兔外周血B细胞，再使用所述培养体系培养。
[0024]优选地，包括如下步骤：将分离出的兔外周血淋巴细胞在包被有特异性抗原的培养容器中孵育；孵育完毕后消化贴壁细胞，得到抗原特异性的B细胞；
[0025]重悬后置于含有所述饲养细胞的培养容器内，然后加入IL-4、IL-10、IL-21和丝裂原进行体外培养。
[0026]本发明还提供了上述培养体系、上述培养方法或上述抗体的制备方法的应用，包含如下(x1)-(x5)中的一种或多种：
[0027](x1)制备兔源单克隆和/或多克隆抗体；
[0028](x2)制备抗体药物；
[0029](x3)构建兔源免疫模型；
[0030](x4)构建噬菌体库；
[0031](x5)高通量测序。
[0032]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0033]本发明提供的兔外周血B细胞的培养体系，包括稳定表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞，CD40L和CD40结合后，可以促进B细胞的生产增殖，是B细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆B细胞的发育。IL-4能够刺激活化B细胞，是B细胞分化成浆细胞的主要因子；IL-10可以诱导B细胞增殖分化。在B细胞存活、增殖中都有重要作用，还能促进抗体的产生；IL-21对B细胞的增殖，抗体的产生也发挥着重要作用。三种白细胞介素协同作用，促进B细胞的增殖和抗体的产生。同时本发明提供的培养体系还包含丝裂原，以促进B细胞的有丝分裂，从而促进B细胞的分化和增殖。
[0034]本发明还提供了一种兔外周血B细胞的培养方法，包括使用上述培养体系培养兔外周血B细胞。该培养方法与上述兔外周血B细胞的培养体系基于相同的发明构思，因此具有上述兔外周血B细胞的培养体系的所有有益效果，再此不再赘述。
[0035]本发明还提供了一种兔抗体的制备方法，该制备方法包括使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞。一方面，使用兔外周血B细胞制备兔源抗体，可以持续得到同一免疫兔子的外周血，进行不同次的重复，而且可以不处死兔子即可完成。另一方面，使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血B细胞可以持续的促进B细胞的增殖和分泌抗体，达到在体外持续产生抗体的目的。
附图说明
[0036]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]图1为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞表达的CD40L分子的SDS-PAGE结果；
[0038]图2为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞中CD40L分子的PCR结果；[0039]图3为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中CD40L分子的SDS-PAGE结果；
[0040]图4为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中CD40L分子的PCR结果；[0041]图5-A为本发明效果例2中待检测细胞的状态图；
[0042]图5-B为本发明效果例2中对照孔中FACS检测结果的直方图；
[0043]图5-C为本发明效果例2中ELISA阳性，FACS检测为阴性的细胞的直方图；[0044]图5-D为本发明效果例2中ELISA检测和FACS检测均为阳性结果的直方图。
具体实施方式
[0045]下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0046]本发明提供了一种兔外周血B细胞的培养体系，包括：饲养细胞、IL-4、IL-10、IL-21、丝裂原和基础培养基；其中，所述饲养细胞包括稳定表达兔源CD40L的细胞。
[0047]在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。CD40L和CD40结合后，可以促进B细胞的生产增殖，是B细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆B细胞的发育。在体外培养中，大部分都是使用EL-B4小鼠细胞作为饲养细胞，人/鼠细胞因子作为添加剂。本发明以表达兔源CD40L的细胞作为饲养细胞与兔外周血B细胞共培养，可以持续的为B细胞提供共刺激分子CD40L，并且该CD40L为兔源分子，可以更好
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