(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010307532.5
(22)申请日 2020.04.17
(71)申请人 马金佑
地址 517400 广东省河源市紫金县敬梓镇
柑坑村紫金县敬梓镇宝明养殖场
(72)发明人 马金佑
(51)Int.Cl.
C12N 9/04(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
(54)发明名称
高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用
(57)摘要
本发明涉及高活性的葡萄糖氧化酶的制备
和应用，酶氨基酸序列(glucose oxidase ，
GenBank:CAA34197.1)在第239位、第240位上发
生突变，由原来的DF突变为AI，其有意效果在于，
获得的突变体葡萄糖氧化酶比野生型酶活性高
76.
09％。权利要求书2页 说明书6页 附图1页CN 111363731 A 2020.07.03
C N 111363731
A
1.高活性的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(glucose oxidase，Ge nBank:CAA34197.1)在第239位、第240位上发生突变，由原来的DF突变为AI，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得葡萄糖氧化酶的序列(glucose oxidase，GenBank:CAA34197.1)1)，交生物公司合成，设计PCR引物5'-GGCTGAAGCTGAATTCACGTGCAACCAGCCTTTCCTCTCTCAT-3'，5'-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCAACTGAACAATGCCCTTGTTTGG-3'，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用PMlⅠ、NotⅠ酶切pPICZαA质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，送生物公司测序，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌； 2)质粒DNA的提取
将上述步骤含有野生型序列质粒的基因工程菌扩大培养，抽提质粒；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒DNA为模板，用PMlⅠ、NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列引物5'-GGCTGAAGCTGAATTCACGTGCAACCAGCCTTTCCTCTCTCAT-3'，5'-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCAAC TGAACAATGCCCTTGTTTGG-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/l Mn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pPICZαA质粒用PMlⅠ、NotⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化大肠杆菌DH5α，涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库； 将步骤三所得阳性转化子混合转入20ml氨苄抗性LB培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取全部质粒，使用NotⅠ将所质粒线性化，使用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，取20μl的线性化DNA加入100μl毕赤酵母GS115感受态细胞混匀立即转入预冷的0.2cm电击杯中，冰浴静置5min，用吸水纸擦
干电击杯外壁的水分，迅速进行电击转化，电转条件：电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω，电击结束后立即加入1ml冰浴的50％1M山梨醇，50％YPD到电击杯中，然后转至1.5ml无菌离心管中，28℃，80r/min培养1h复苏；
5)酵母转化子筛选
取100μl步骤四所得的复苏菌液涂布到显筛选培养基上28℃倒置培养，观察转化子生长状况，将红显圈比野生型对照大的转化子，挑出，进行复筛；
6)将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序，测序结果见表3；
7)酶的生产；
8)酶的纯化，使用阴离子交换树脂纯化蛋白；
9)进行GOD酶活力检测和SDS-PAGE分析；
10)采用Bradford测定蛋白质浓度。
2.根据权利要求1所述的高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用，其特征在于，所述酶用
高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及高活性的葡萄糖氧化酶的制备和应用。
背景技术
[0002]葡萄糖氧化酶(GOD，β-D-glucose,EC 1.1.3.4)的化学本质是一种糖蛋白，在整个蛋白质分子中，糖基部分占蛋白分子量的16％，大约80％的糖是甘露糖及相应衍生物，糖基与蛋白质的主链通过N-或O-糖苷键连接。葡萄糖氧化酶具有高效性、专一型、无毒副作用等优点，能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸从而产生杀菌、脱氧、去除葡萄糖等特殊效果，被广泛应用于化工、食品、医药、饲料等多种领域，在食品领域，GOD作为一种重要的食品添加剂，以粉末或者液体的形式添加到各种食品和饮料中，能够消除食品中的氧气，防止腐败，延长食品保质期，用于牛奶保鲜，啤酒脱氧，蛋白制品脱糖和烘焙等食品行业；饲料中添加GOD可以改善动物肠道环境，帮助消化，促进动物健康生长，含葡萄糖氧化酶、乳铁蛋白和乳酸过氧化物的混合饲料添加剂，不仅可以预防牲畜胃肠道感染和腹泻，还可以促进动物生长，葡萄糖氧化酶在动物肠道中催化葡萄糖氧化产生过氧化氢和葡萄糖酸，过氧化氢在
肠道内积累到一定浓度时，可以直接抑制大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、弧菌、葡萄球菌等病原微生物的生长繁殖，这种特殊的作用机理和抗生素完全不同，不会使得病原菌产生菌体抗药性；根据葡萄糖氧化酶独特的酶学特性，制成的尿糖试纸和血糖检测试剂盒已被广泛地应用临床诊断中，例如血糖的测定和尿糖的检测；在生产纺织品的过程中通常需要用到大量漂白剂，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化反应中产生的过氧化氢可以充当漂白剂的作用。
[0003]昆虫、细菌以及霉菌微生物中都发现了GOD，昆虫中葡萄糖氧化酶的含量较低，大规模获取样品困难，并且提取和分离纯化工艺复杂，难以进行工业化生产，微生物培养方便，可以通过高密度发酵大量获得，便于进行大规模生产，通过微生物发酵来生产GOD成为主流。目前国内市场上的葡萄糖氧化酶主要是通过黑曲霉和青霉的发酵进行大规模生产。商用酶需要具有高特异性、稳定性、高活性，已经针对葡萄糖氧化酶的商业应用开展了一系列研究。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供具有更高酶活的葡萄糖氧化酶。
[0005]本发明的制备过程如下：
[0006] 1.从NCBI上获得葡萄糖氧化酶的序列(glucose oxidase，GenBank:CAA34197.1) 1)，交生物
公司合成，设计PCR引物5'-GGCTGAAGCTGAATTCACGTGCAACCAGCCTTTCCTCTCTCAT-3'，5'-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCAACTGAACAATGCCCTTGTTTGG-3'，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用PMlⅠ、NotⅠ酶切pPICZαA质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化大肠杆菌
DH5α，挑取阳性克隆，送生物公司测序，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；[0007] 2.质粒DNA的提取
[0008]将上述步骤含有野生型序列质粒的基因工程菌扩大培养，抽提质粒；
[0009] 3.易错PCR扩增与突变文库的构建
[0010]以步骤二获得的质粒DNA为模板，用PMlⅠ、NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列引物5'-GGCTGAAGCTGAATTCACGTGCAACCAGCCTTTCCTCTCTCAT-3'，5'-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCC GCAACTGAACAATGCCCTTGTTTGG-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/l Mn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20
μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pPICZαA质粒用PMlⅠ、NotⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化大肠杆菌DH5α，涂布于固体LB 平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；
[0011] 4.重组质粒的电击转化
[0012]将步骤三所得阳性转化子混合转入20ml氨苄抗性LB培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取全部质粒，使用NotⅠ将所质粒线性化，使用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，取20μl的线性化DNA加入100μl毕赤酵母GS115感受态细胞混匀立即转入预冷的0.2cm电击杯中，冰浴静置5min，用吸水纸擦干电击杯外壁的水分，迅速进行电击转化，电转条件：电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω，电击结束后立即加入1ml冰浴的50％1M山梨，50％YPD到电击杯中，然后转至1.5ml无菌离心管中，28℃，80r/min培养1h复苏；
[0013] 5.酵母转化子筛选
[0014]取100μl步骤四所得的复苏菌液涂布到显筛选培养基上28℃倒置培养，观察转化子生长状况，将红显圈比野生型对照大的转化子，挑出，进行复筛；
[0015] 6.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序，测序结果见表3；
[0016]7.酶的生产；
[0017]8.酶的纯化，使用阴离子交换树脂纯化蛋白；
[0018]9.进行GOD酶活力检测和SDS-PAGE分析；
[0019]10.采用Bradford测定蛋白质浓度。
[0020]本发明的有益效果是：
[0021]获得了比野生型酶活性更高的突变体葡萄糖氧化酶。
附图说明
[0022]图1葡萄糖氧化酶SDS-PAGE电泳图
[0023]图2野生型及突变体葡萄糖氧化酶三维图
具体实施方式
[0024]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
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