(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510183861.2
(22)申请日 2015.04.17
C12N 5/071(2010.01)
(71)申请人陕西博溪生物科技有限公司
地址710065 陕西省西安市南二环青龙小区
伟业都市远景1幢10C 号
(72)发明人明磊国 张勇杰 卢永波
(74)专利代理机构陕西增瑞律师事务所 61219
代理人
孙卫增
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种全层皮肤模型的构建方法，
表皮细胞组成的表皮层，可用于替代动物皮肤组
织进行化妆品等的物质检测；本发明通过梯度时
间进行真皮层细胞的接种，同时联合Vc 的使用，
促使真皮层的细胞大量分泌胶原并形成成熟的胞
外基质，在细胞复层化的过程中胞外基质又为细
胞提供了天然的三维支架和生长空间，提高了其
生物活性和生物相容性；同时，通过多次借种与
细胞增殖自身的复层化过程相结合，增加了真皮
层的厚度、机械强度、稳定性；真皮层与表皮结合
及生物学功能的发挥。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书6页 附图1页
(10)申请公布号CN 104726396 A (43)申请公布日2015.06.24
C N 104726396
A
1.一种全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：该全层皮肤模型无外源材料支架，具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层；
其构建方法，包括以下方法步骤：
步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养
成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml-1、透明质酸300U·ml-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含培养液Ⅱ调整细胞密度每毫升2×105～4×105细胞接种，5％CO
、37℃条件下培养；
2
表皮细胞的分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入I培养液，吹打至均匀；按照3×104～5×104/cm2的密度接种，移入5％CO
、37℃条件下培养，
2
取第3～7代细胞用于构建；
所述培养液I，为DMEM含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS溶液；
所述培养液Ⅱ，为10％FBS+90％DMEM。
步骤二、真皮层构建
取第5～10代成纤维细胞，每毫升培养液Ⅲ含0.5×106～3×106个成纤维细胞，置于、37℃条件下培养2～3小时；加入培养液Ⅳ，每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一5％CO
2
次，共培养12～14天；
所述培养液Ⅲ，是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维生素C；
为3～5mg/ml，孕酮所述培养液Ⅳ，为体积比75％DMEM+25％DMEM/F12，添加NaHCO
3
30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ml；
步骤三、表皮层构建
将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×105～1.5×105个/cm2接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO
、37℃孵箱培养，每隔22～26小时
2
换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤；
其中，培养液Ⅴ-SK1：培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+KGF(0.5～5ng/ ml)+GM-CSF(2.5～10ng/ml)；
步骤四、全层皮肤的培养
将制备的全层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束；
培养液Ⅴ-SK2：培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表
皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；
培养液Ⅴ-SK3：培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；
培养液Ⅴ-SK4：培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ ml)。
2.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤一的表皮细胞的分离培养中，所述消化液含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS。
3.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤四中的培养条件，
环境。
均为37℃，5％CO
2
一种全层皮肤模型的构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种可替代皮肤进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效检测及其他与皮肤接触的材料的安全性与功效性评价的全层皮肤模型的构建方法。
背景技术
[0002] 皮肤模型是指利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工制备的皮肤替代品。全层皮肤模型与正常皮肤结构高度类似，具有完整的表皮层和真皮层结构，除可用来修复、替代缺损的皮肤组织外，其最大的用途在于替代人体皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品、与皮肤接触材料的安全性与功效性评价。
[0003] 真皮层的体外构建技术是全层皮肤模型开发的关键。目前，主要有两种类型的技术：一种是应
用材料学和生物工程学原理构建的真皮替代物，该类体外构建技术不利于细胞生长，难以实现替代真皮组织进行细胞功能的检测与评价。另一类是应用细胞复合材料培养的方法，比如以胶原等天然材料为支架，复合成纤维细胞构建成真皮层，并于其上接种表皮细胞，进一步构建成全层皮肤结构(如专利CN101062429、CN103041453A)。但此法获得的人工皮肤无法完全替代皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、皮肤接触性材料等的测试评价要求。用支架材料和活细胞构建的皮肤模型在培养过程中伴随着活细胞自身胶原的分泌以及支架材料的降解，导致人工皮肤组织收缩现象，严重影响全层皮肤模型体外构建中的传质效率，造成边缘收缩与培养器皿壁的分离，同时真表皮层之间不能形成与天然皮肤一致的基底膜结构，均对体外测试结果有影响。[0004] 目前尚未有不采用支架材料，仅依靠细胞自身分泌的细胞外基质构建形成的真皮层结构以及由真皮层支持生发的表皮结构结合形成的全层皮肤结构。
发明内容
[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的是：构建一种全层皮肤模型，该皮肤模型不含外源支架材料，具有成纤维细胞及自分泌细胞外基质组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层，结构更接近人体皮肤结构，具有良好的力学性能、结构稳定性和细胞应答敏感性等特点，可应用于多种皮肤替代测试。
[0006] 本发明的全层皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养
[0008] 成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml-1、透明质酸300U·ml-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用培养液Ⅱ调整细胞密度，每毫升2×105～4×105个/cm2细胞接种，5％CO
、37℃条件下培养；
2
[0009] 表皮细胞分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下
16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，维持37℃消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入培养液I，吹打至均匀；按照3×104～5×104个/cm2的密度接种，移入5％CO
2
、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建。
[0010] 其中培养液I为DMEM(sigma公司生产)，含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、
丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清(FBS)+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。
[0011] 步骤二、真皮层构建
[0012] 取第5～10代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含0.5×106～3×106个成纤维
细胞进行接种，置于5％CO
2
、37℃条件下培养2～3小时，加入培养液Ⅳ培养；每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天。
[0013] 其中培养液Ⅲ是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维
生素C(V
C )；培养液Ⅳ为75％DMEM+25％DMEM/F12(体积比为3：1)，添加NaHCO
3
为3～5mg/
ml，孕酮30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ ml。
[0014] 步骤三、表皮层构建
[0015] 将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×105～1.5×105个/cm2接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO
2
、37℃条件下培养，每隔22～26小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤。其中，培养液Ⅴ-SK1：培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+角质细胞生长因子(KGF)(0.5～5ng/ml)+粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(2.5～10ng/ml)；
[0016] 步骤四、全层皮肤的培养
[0017] 将制备的双层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束，得到全层皮肤。
[0018] 步骤四中的培养条件均为37℃，5％CO2环境。
[0019] 其中，培养液Ⅴ-SK2：培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；培养液Ⅴ-SK3：培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；培养液Ⅴ-SK4：培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ml)。[0020] 本发明所构建的模型，是通过维生素C诱导成纤维细胞快速增殖并大量分泌胞外基质，胞外基质与细胞均匀分布和排列形成的多层细胞膜片，其厚度达到200～300μm；膜片形成后在膜片上进行表皮细胞接种，接种后进行复层化培养，待表皮复层化且厚度达到150～200μm后，全层皮肤模型构建成功。
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