复合菌种及其在高盐高脂皮革废水处理中的应用的制作方法

1.本发明涉及废水治理技术领域，特别涉及复合菌种及其在高盐高脂皮革废水处理中的应用。

背景技术：

2.制革废水是指制革生产在准备和鞣制阶段产生的废水，制革厂废水排放量大、污染物种类繁多，成分复杂。皮革厂排出的油脂废水中含有较高浓度的动物油脂及大量悬浮物，具有盐分含量高、营养成分高、易腐发臭等特点，若未经处理直接排放至自然水体中，形成油膜后会阻碍大气溶氧，阻隔水体中氧的来源，从而降低水体的溶氧量，影响水体自然净化过程，危害水体生态系统，严重污染周围环境。
3.皮革废水中含有的主要油类物质为动物油脂，总油含量达到10000mg/l以上，全盐含量超过100000mg/l，动物油脂属于难生物降解的有机物，若不进行预处理直接排入废水处理系统会对生化系统造成冲击，破坏正常的水处理工艺，皮革厂对油脂废水常用的处理方法为化学絮凝，通过添加硫酸亚铁去除废水中的部分油脂，含油脂的废渣将作为危废进行处理，不仅加重了环境负担，而且提高了废水处理成本。
4.针对皮革废水高盐高脂的特点，急需提供一种高效的耐盐脱脂菌剂，使其对废水中的动物油脂实现高效降解。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了复合菌种及其在高盐高脂皮革废水处理中的应用，该复合菌种对废水中的动物油脂具有高效降解作用。
6.本发明复合菌种包括保藏编号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)和枯草芽孢杆菌。
7.本发明中，所述枯草芽孢杆菌优选为保藏编号为cgmcc no.16167的菌株。实验表明，菌株pg5和pg8等比例复配后对猪油的降解效果显著，24h降解率达到97.88％，所述菌株pg5保藏编号为cgmcc no.16167的枯草芽孢杆菌，pg8(yjy22-13)即保藏号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌。
8.所述枯草芽孢杆菌已于2018年7月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.16167，乙酸钙不动杆菌于2022年1月中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.24322。
9.所述枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，无荚膜，短杆状，在显微镜下观察呈快速游动状态，在普通营养琼脂上形成不规则突起的菌落，菌落表面光滑不透明，有褶皱；所述乙酸钙不动杆菌属革兰氏阴性菌，球杆菌，常见成对排列，也可单个存在，有时形成丝状和链状，有荚膜，无鞭毛，不产芽孢，在普通营养琼脂上形成近圆形中等的乳白菌落，菌落扁平，湿润。
10.一些实施方案中，所述乙酸钙不动杆菌和枯草芽孢杆菌的有效菌数量之比为1:
(0.8～3)。一些具体实施例中，所述乙酸钙不动杆菌和枯草芽孢杆菌的有效菌数量之比为1:1。
11.本发明还提供一种微生物菌剂，其原料包括本发明所述的复合菌种。
12.一些实施方案中，所述微生物菌剂包括复合菌种的活菌、或其培养物、提取物中的至少一种。
13.本发明还提供了所述微生物菌剂的制备方法，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂，其制备方法如下：
14.分别将cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌和保藏编号为cgmccno.16167的枯草芽孢杆菌活化、制备种子液，然后分别接种于发酵培养基中发酵，收集发酵后的菌体，获得液体菌剂；
15.将所述液体菌剂依次进行吸附、干燥和粉碎，获得固体菌剂。
16.本发明中，所述吸附、干燥、粉碎均采用本领域常规手段完成即可，本发明不作具体限定。
17.一些实施方案中，所述活化为室温条件下活化3h～8h。一些具体实施例中活化时间具体可为3h、4h、5h、6h、7h或8h。
18.一些实施方案中，所述种子液的制备包括：将活化后的菌种接种至液体培养基中，于温度为28-38℃，摇床转速为100-200r/min的条件下，振荡培养15-20h。
19.一些实施方案中，所述发酵为：将所述菌种的种子液按体积百分比1％-5％的接种量分别接种于发酵培养基中进行高密度发酵；所述高密度发酵的条件为：罐压0.02-0.05mpa，温度为28～38℃，转速为200-400r/min，溶解氧≧20％，时间为15～36h。
20.其中，所述枯草芽孢杆菌发酵的培养基包括：豆粕2％-3.5％、玉米粉3％-4％、麦芽糊精1.8％-3.2％、尿素0.1％-0.16％、碳酸钙0.1％-0.3％、磷酸氢二甲0.2％-0.3％、硫酸镁0.05％-0.15％、硫酸锰0.01％-0.02％、聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
21.所述乙酸钙不动杆菌发酵的培养基包括：麦芽糊精0.3％-0.55％、玉米粉0.35％-0.55％、酵母粉1％-2％、玉米浆干粉1％-3％、硫酸二氢钾0.1％-0.2％、硫酸镁0.2％-0.4％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。
22.本发明还提供了所述的复合菌种、所述的微生物菌剂或，在处理高盐高脂皮革废水中的应用。
23.本发明还提供一种高盐高脂皮革废水的处理方法，其为：将本发明所述的复合菌种、所述的微生物菌剂或添加到高盐高脂皮革废水中。
24.一些实施方案中，按照废水中有效活菌菌量≥105cfu/ml的量添加所述复合菌种或所述微生物菌剂。
25.溶解氧过高不利于菌种分裂繁殖，处理过程中溶解氧过高还会将好氧池活性污泥打碎，不利于菌剂附着，同时还会伴随浮泥、跑泥，导致整个生化系统瘫痪。一些实施方案中，所述高盐高脂皮革废水的处理条件为：溶解氧1-6mg/l，温度20-35℃，ph6-8。
26.本发明中，使用固体微生物菌剂处理高盐高脂皮革废水时，先对固体菌剂进行活化，活化具体为：将所述微生物固体菌剂与水按照1:3-10的质量比混合均匀，于搅拌容器内搅拌活化16-24h；一些优选的实施方案中，所述水中还包括葡萄糖1-3％、硫酸铵0.02-0.05％和磷酸氢二甲0.02-0.05％。
27.本发明提供的复合菌种包括保藏编号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)和保藏编号为cgmcc no.16167的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。实验表明，在体系全盐为100000mg/l时，该复合菌对初始浓度为5000mg/l的油脂24h降解率达97.88％，将该菌剂应用于高盐高脂皮革废水生化处理时，体系全盐含量110000mg/l左右，油脂含量15000mg/l左右，投加万分之一的菌剂4d后出水油脂即降至100mg/l以下，6d后出水稳定在5mg/l以下。表明，本发明所述复合菌及微生物菌剂对废水中的动物油脂具有高效降解作用，能够减轻高盐高脂废水对生化处理系统的冲击，提高该股废水的处理效率，节省预处理工艺，降低了成本，且不会对环境造成二次污染，具有显著的经济与环保效益。
28.生物保藏说明
29.yjy22-13，分类命名：乙酸钙不动杆菌acinetobacter calcoaceticus，于2022年1月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24322。
附图说明
30.图1为实施例1高盐高脂皮革废水降解菌株耐盐筛选试验结果图；
31.图2为实施例4高盐高脂皮革废水降解菌剂小试验证中空白组出水趋势图；
32.图3为实施例4高盐高脂皮革废水降解菌剂小试验证中加菌组出水趋势图；
33.图4为实施例5高盐高脂皮革废水降解菌剂应用试验生化池对比图；
34.图5为实施例5高盐高脂皮革废水降解菌剂应用试验出水趋势图。
具体实施方式
35.本发明公开了复合菌种及其在高盐高脂皮革废水处理中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
36.下面结合实施例，进一步阐述本发明，其中，枯草芽孢杆菌已于2018年7月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.16167。
37.实施例1高盐高脂皮革废水降解菌株的筛选
38.1)脱脂菌株筛选
39.以皮革废水生化处理装置中的活性污泥为试验基质，进行菌株的分离纯化，最终纯化得到7株菌株，加上实验室菌种库保藏的具有除油功能的菌株5株，以猪油为降解对象进行有效菌株筛选，将发酵菌液按照5％接种量接种至含5000mg/l猪油的无机盐培养基中，37℃、180rpm震荡培养，结果见表1，共筛选得到10株菌株对猪油有降解效果，对初始浓度5000mg/l的猪油24h降解率达到50％以上的菌株共5株，其中pg5和pg7的降解率达到90％以上。
40.表1脱脂菌株筛选试验结果
[0041][0042]
2)菌株耐盐筛选
[0043]
以筛选到的脱脂率达到50％以上的5株菌株为试验对象，进行耐盐性筛选，以od600为评价指标，挑取单菌落分别接种与含有不同盐浓度的lb培养基中，过夜培养后进行菌液od600的检测，结果见图1，菌株pg5、pg8和pg11对全盐耐受性最高，体系中全盐含量达到90000mg/l时菌株生长未受到影响，全盐含量达到150000mg/l时仍有繁殖，确定三株菌株为高盐高脂皮革废水降解菌株。
[0044]
实施例2高盐高脂皮革废水降解菌剂的复配
[0045]
将筛选到的3株高盐高脂皮革废水降解菌株pg5、pg8和pg11为试验菌株进行菌剂的复配优化，按照依次排序的原则进行菌株的等比例复配，并进行菌剂效果验证，将发酵菌液按照5％接种量接种至含5000mg/l猪油的无机盐培养基中，全盐含量为100000mg/l，37℃、180rpm震荡培养，结果见表2，菌株pg11复配后对猪油降解产生一定的拮抗作用，菌株pg5/pg8等比例复配后对猪油的降解效果最好，24h降解率达到97.88％，确定高盐高脂皮革废水降解菌剂为pg5/pg8复配菌剂，两菌株均为实验室保藏菌株，pg5为枯草芽孢杆菌，pg8为乙酸钙不动杆菌yjy22-13。
[0046]
表2降解菌剂的复配
[0047][0048]
实施例3高盐高脂皮革废水降解菌剂的制备
[0049]
(1)菌种活化：将保存于4℃的枯草芽孢杆菌和乙酸钙不动杆菌菌种取出，置于室
温下活化3h，由于菌种保藏于试管斜面营养琼脂培养基上，活化过程无需补加营养；
[0050]
(2)液体种子制备：在无菌操作台中，用移液取10ml无菌水加入菌种保藏管内，并利用移液器反复吹打制备菌悬液，然后将菌悬液接种至200ml液体培养基中，振荡培养20h，培养条件为：温度35℃，振荡转速170r/min；
[0051]
(3)高密度发酵：将枯草芽孢杆菌或乙酸钙不动杆菌液体种子按体积比1.5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵；发酵条件为：温度35℃，转速200r/min，培养时间为20h；
[0052]
枯草芽孢杆菌高密度培养基配方：豆粕2％-3.5％、玉米粉3％-4％、麦芽糊精1.8％-3.2％、尿素0.1％-0.16％、碳酸钙0.1％-0.3％、磷酸氢二甲0.2％-0.3％、硫酸镁0.05％-0.15％、硫酸锰0.01％-0.02％、聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
[0053]
枯草芽孢杆菌高密度发酵条件：罐压0.02mpa，温度35℃，转速200r/min，溶解氧30％，培养时间为36h；
[0054]
乙酸钙不动杆菌高密度培养基配方：麦芽糊精0.3％-0.55％、玉米粉0.35％-0.55％、酵母粉1％-2％、玉米浆干粉1％-3％、硫酸二氢钾0.1％-0.2％、硫酸镁0.2％-0.4％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水；
[0055]
乙酸钙不动杆菌高密度发酵条件：罐压0.02mpa，温度35℃，转速200r/min，溶解氧30％，培养时间为12h；
[0056]
(4)干燥粉碎：将上述发酵得到的菌体进行吸附、干燥、粉碎，得到固体高盐高脂皮革废水降解菌剂；
[0057]
通过平板计数法检测，所得高盐高脂皮革废水降解菌剂有效活菌数为136.52亿cfu/g。
[0058]
实施例4高盐高脂皮革废水降解菌剂小试验证
[0059]
取山东沾化某皮革厂生产废水及生化污泥进行菌剂小试验证，高盐高脂皮革废水总油含量为12800mg/l，全盐含量95300mg/l，取5l烧杯，加入生化污泥4l，高盐高脂皮革废水进水量为50％，每天进出水一次，分别将保存的枯草芽孢杆菌和乙酸钙不动杆菌在超净工作台中接入无菌的lb液体培养基中，37℃、180rpm震荡培养16-20h，培养好的菌液以体积比5％的接种量接入小试体系中，室温曝气培养，同时设置空白对照体系，每天跟踪检测出水总油含量，连续跟踪检测20d，结果见图2和图3，空白组出水总油呈上升趋势，7d后总油含量维持在10000mg/l以上，加菌组前7d体系出水中总油含量呈现直线下降趋势，由535.18mg/l降至7.23mg/l，从第8d开始体系出水总油维持在5mg/l以下，相比空白组，加菌组油脂降解率维持在99％以上。
[0060]
实施例5高盐高脂皮革废水降解菌剂应用
[0061]
山东沾化某皮革厂生化系统受高浓度油脂废水冲击，造成泡沫漫池，溶解氧下降，出水指标居高不下，经检测分析生化系统中油脂含量达到15000mg/l左右，系统全盐含量110000mg/l左右，针对此情况投加高盐高脂皮革废水降解菌剂，具体使用方法如下：
[0062]
(1)菌剂投加：计算污水处理系统曝气池有效池容(或保有水量)，按照万分之一的投加量进行菌剂的投加；
[0063]
(2)调试检测：菌剂投加完成后，调试曝气池参数：溶解氧4mg/l，ph7.0，并每间隔24h取曝气池出水检测污染物指标；
[0064]
跟踪检测14d，结果如图4所示系统受到冲击时好氧池表面泡沫弥漫，加菌剂调试7d后池面泡沫散去，露出好氧污泥。图5所示出水中油脂含量的变化，呈直线下降趋势，加菌剂6d后出水油脂含量降至5mg/l左右，后期一直稳定在5mg/l以下。
[0065]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种复合菌种，其特征在于，包括保藏编号为cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)和保藏编号为cgmcc no.16167的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。2.根据权利要求1所述的复合菌种，其特征在于，所述乙酸钙不动杆菌和枯草芽孢杆菌的有效菌数量之比为1:(0.8～3)。3.一种微生物菌剂，其特征在于，其原料包括权利要求1或2所述的复合菌种。4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的复合菌种的活菌、或其培养物、提取物中的至少一种。5.权利要求3或4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂，其制备方法如下：分别将cgmcc no.24322的乙酸钙不动杆菌和保藏编号为cgmccno.16167的枯草芽孢杆菌活化、制备种子液，然后分别接种于发酵培养基中发酵，收集发酵后的菌体，获得液体菌剂；将所述液体菌剂依次进行吸附、干燥和粉碎，获得固体菌剂。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述活化为室温条件下活化3h～8h；所述种子液的制备包括：将活化后的菌种接种至液体培养基中，于温度为28-38℃，摇床转速为100-200r/min的条件下，振荡培养16-20h。所述发酵为：将所述菌种的种子液按体积百分比1％-5％的接种量分别接种于发酵培养基中进行高密度发酵；所述高密度发酵的条件为：罐压0.02-0.05mpa，温度为28～38℃，转速为200-400r/min，溶解氧≧20％，时间为15～36h。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌发酵的培养基包括：豆粕2％-3.5％、玉米粉3％-4％、麦芽糊精1.8％-3.2％、尿素0.1％-0.16％、碳酸钙0.1％-0.3％、磷酸氢二甲0.2％-0.3％、硫酸镁0.05％-0.15％、硫酸锰0.01％-0.02％、聚醚消泡剂0.1％，余量为水；所述乙酸钙不动杆菌发酵的培养基包括：麦芽糊精0.3％-0.55％、玉米粉0.35％-0.55％、酵母粉1％-2％、玉米浆干粉1％-3％、硫酸二氢钾0.1％-0.2％、硫酸镁0.2％-0.4％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。8.权利要求1或2所述的复合菌种、权利要求3或4所述的微生物菌剂或权利要求5～7任一项所述的制备方法制得的微生物菌剂，在处理高盐高脂皮革废水中的应用。9.一种高盐高脂皮革废水的处理方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的复合菌种、权利要求3或4所述的微生物菌剂或权利要求5～7任一项所述的制备方法制得的微生物菌剂添加到高盐高脂皮革废水中。10.根据权利要求9所述的处理方法，其特征在于，按照废水中有效活菌菌量≥105cfu/ml的量添加所述复合菌种或所述微生物菌剂。11.根据权利要求9所述的处理方法，其特征在在于，所述高盐高脂皮革废水的处理条件为：溶解氧1-6mg/l，温度20-35℃，ph6-8。

技术总结

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及复合菌种及其在及其在高盐高脂皮革废水处理中的应用。该复合菌种包括保藏编号为CGMCCNO.24322的乙酸钙不动杆菌和保藏编号为CGMCCNo.16167的枯草芽孢杆菌。实验表明，在体系全盐为100000mg/L时，该复合菌对初始浓度为5000mg/L的油脂24h降解率达97.88％，表明本发明所述复合菌及微生物菌剂对废水中的动物油脂具有高效降解作用，能够减轻高盐高脂废水对生化处理系统的冲击，提高该股废水的处理效率，节省预处理工艺，具有显著的经济与环保效益。益。