一种具有黑素抑制活性的多肽及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种具有黑素抑制活性的多肽及其应用。

背景技术：

2.多肽是一种较短的氨基酸链，且具备的活性越来越收到国内外学者的关注。自然存在的多肽具有细胞通信功能，如蛋白质调节、细胞增殖、细胞迁移、炎症、血管生成和黑素生成，同时引起多种生理过程，包括防御、免疫、应激等。美白的关键在于抑制黑素的生成，本发明合成开发一种高纯度肽类，具备优异的黑素抑制、及美白效果。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种具有黑素抑制活性的多肽及其应用。
4.本发明所采用的技术方案为：
5.一种具有黑素抑制活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为fdgf，结构式为：
[0006][0007]
所述多肽在制备美白产品中的应用。
[0008]
进一步的，所述的美白产品的使用形式可以为皮肤涂抹式、皮肤导入式或口服式。所述的美白产品中fdgf的浓度为10ppm至1000ppm。
[0009]
本发明还提供一种具有美白功效的化妆品，其含有所述的多肽。
[0010]
本发明还提供一种具有美白功效的食品，其含有所述的多肽。
[0011]
本发明还提供一种具有美白功效的药品，其含有所述的多肽。
[0012]
本发明的有益效果如下：
[0013]
本发明提供了一种小分子的多肽，其具有优异的酪氨酸酶抑制功能以及黑素抑制生成功能，可应用于化妆品、医美、保健等领域，具有极大的应用价值。
附图说明
[0014]
图1是hplc法对所合成的多肽进行纯度测定结果。
[0015]
图2是本发明产物质谱结果。
[0016]
图3是本发明多肽fdgf的黑素生成抑制效果图。
[0017]
图4是不同浓度的fdgf酶标仪吸光度测试结果。
[0018]
图5是本发明多肽fdgf的酪氨酸酶抑制活性结果。
具体实施方式
[0019]
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制。
[0020]
下述各实施例中所述的实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
[0021]
实施例1多肽fdgf的合成
[0022]
本实施例仅提供多肽fdgf的一种具体合成方法，所述多肽也可采用其他的全化学合成多肽技术制得，或采用其他可行方法制得。
[0023]
在多肽固相合成反应器中加入100mg trityl树脂，用二氯甲烷(dcm)浸泡5min溶胀；fmoc-l-苯丙氨酸-oh溶解于5ml dcm，再加入n,n-二异丙基乙胺(diea)，充分溶解后，加入到装有树脂的容器中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入5ml 20％(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc保护基；将fmoc-l-天冬氨酸-oh，o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)，diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入5ml 20％(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc保护基；将fmoc-l-甘氨酸-oh，hbtu，diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；用10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；加入5ml 20％(piperidine)的dmf溶液至树脂中，鼓氮气充分搅拌，反应20min脱去fmoc保护基；将fmoc-l-苯丙氨酸-oh，hbtu，diea加入5ml dmf中充分溶解，将上述溶液加入树脂中，鼓氮气充分搅拌反应60min；期间用茚三酮溶液显反应检测氨基酸偶联反应是否完全；如检测显蓝，则继续反应；如反应不显，则反应完成。用10ml dmf洗涤树脂，去掉滤液，保留树脂，一共洗5次；洗涤完的树脂，用5ml dcm再洗涤5次，鼓氮气，抽干dcm；加入5ml切割试剂至树脂中，鼓氮气充分搅拌切割反应50min；过滤处理，收集液体；将液体滴加至40ml冰乙醚中，析出白固体；离心收集白固体，弃掉上清液；白固体溶于水/乙腈(10/90，添加0.1％三氟乙酸)中，液体样品用0.22um滤膜过滤后，进样至hplc中分离纯化；纯化样品经质谱，hplc检测后，符合纯度要求的样品收集，用冻干机冻干，得到冻干多肽粉末。按上述方法合成得到fdgf。
[0024][0025]
实施例2合成多肽鉴定及纯度测定
[0026]
使用hplc法对所合成的多肽进行纯度测定。参数设定如下：流动相a为0.065％三氟乙酸水溶液，流动相b为0.05％的三氟乙酸乙腈溶液；总流速为1ml/min；检测波长220nm；检测柱为inertsil ods-sp 4.5*250mm；流动相梯度见表一，检测得到纯度为97.29％，见图
1。
[0027]
使用lc-ms对合成多肽进行结构验证，设置参数如下。离子源：esi，雾化气体流速：1.5l/min，cdl temp：250，block temp：200，离子源电压：+4.5kv，干燥气体流速：5l/min，总流速0.2ml/min。所得质谱结果与目标多肽一致，测定相对分子质量为484.1(图2)，证明成功合成了fdgf多肽，且其纯度为97.29％。
[0028]
表1
[0029]
时间/min0.0125.0025.0127.0027.0135.00b相浓度5％65％95％95％5％5％
[0030]
实施例3黑素抑制活性测定
[0031]
将生长于dmem培养基、处于对数生长期的b16细胞，以(10-15)
×
104个/孔细胞数接种于100mm细胞培养皿中，每孔加入10ml培养液，置于37℃、5％co2浓度的二氧化碳培养箱中孵育。24h后加入fdgf的pbs溶液至其浓度为10ppm，设3个复孔，继续孵育。培养24h后，用胰酶消化收集细胞，弃去上清液，用pbs洗涤2次，每管加300μl含有10％dmso的1n naoh裂解细胞，于80℃水浴30min。吸取100μl细胞裂解液加入96孔板中，用酶标仪在405nm处测定吸光度。具体的实验结果见图3，实验结果表明，多肽fdgf具有优异的黑素生成抑制效果。在10ppm浓度下，fdgf黑素生成抑制率为25.3％。
[0032]
实施例4安全浓度测定
[0033]
s1.b16f10细胞用完全培养液，按1
×
105个/ml的密度传代，37℃，5％co2条件下培养24～36h。
[0034]
s2.将盖玻片放置于计数板计数区上，同时取10ul细胞液，加到计数区，放置于倒置显微镜下，计数4个角的细胞数，并求平均值；重复该步骤三次，获得平均值n，即细胞数为n*104个/ml。(n为5-10个细胞)
[0035]
s3.接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液，blank组不加细胞，加完全培养基，nt组加细胞，不加样品，周围一圈加100μl pbs。放入培养箱孵育24h。
[0036]
s4.用pbs稀释样品，并过滤成无菌溶液，按倍数稀释，一般为百、千、万、十万倍，稀释方法根据实验需要可进行调整。放入培养箱孵育24h。取出96孔板，用pbs清洗一次，加入新的完全培养基。每个孔加样10μl,重复5个孔。放入培养箱孵育24h。
[0037]
s5.用pbs清洗2次。用不完全培养基配10％cck8溶液，每个孔加100μl,放置培养箱1-4h。随时观察颜，变深即可用酶标仪测吸光度。
[0038]
s6.打开酶标仪，设置双波长(上450，下650)和区域。读取reduction
→
wavelength options：！lm1-！lm2，display
→
reduced data，将所得数据作图，如图4所示。
[0039]
结果显示，目标多肽fdgf在10ppm至1000ppm的浓度范围内均无细胞毒性，可安全作用于人体皮肤。
[0040]
实施例5酪氨酸酶抑制活性测定
[0041]
将生长于dmem培养基、处于对数生长期的b16细胞，以(5-10)
×
104个/孔细胞数接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100μl培养液，置于37℃、5％co2浓度的二氧化碳培养箱中孵育。24h后加入α-msh促黑(1μl/100μl)，继续孵育。24h后每孔加入10μl样品，每一浓度设5个复孔，继续孵育。培养24h后，弃去上清液，用pbs洗涤3次，每孔加质量分数为1％的辛基酚聚氧乙烯醚(triton x-100)溶液80μl，迅速置于－81℃冻存30min。随后室温融化使细
胞完全破裂，37℃预温5min后加入质量分数为1％的l-dopa溶液20μl。37℃反应2h，在酶标仪490nm处测其吸光度并作图，见图5。
[0042]
结果表明，所测试的3个浓度均存在显著的酪氨酸酶抑制活性，其中10ppm浓度的fdgf多肽具有最高的抑制率，其抑制率为32.52％。
[0043]
可以看出，本发明的多肽fdgf可以作为有效成分加入美白产品中，涂抹或导入皮肤中发挥抑制酪氨酸酶、抑制黑素生成的作用，此外，也有望应用于可口服的美白产品中。
[0044]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种具有黑素抑制活性的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为fdgf，结构式为：2.权利要求1所述的多肽在制备美白产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的美白产品的使用形式为皮肤涂抹式、皮肤导入式。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的美白产品的使用形式为口服式。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的美白产品中fdgf的浓度为10ppm至1000ppm。6.一种具有美白功效的化妆品，其特征在于，含有如权利要求1所述的多肽。7.一种具有美白功效的食品，其特征在于，含有如权利要求1所述的多肽。8.一种具有美白功效的药品，其特征在于，含有如权利要求1所述的多肽。9.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的多肽。

技术总结

本发明公开了一种具有黑素抑制活性的多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为FDGF，其具有优异的黑素生成抑制效果，能够用于美白产品，可为化妆品原料开发提供一种新方向。可为化妆品原料开发提供一种新方向。可为化妆品原料开发提供一种新方向。可为化妆品原料开发提供一种新方向。

技术研发人员：

叶章颖 王菁 郑雅文

受保护的技术使用者：

浙江大学

技术研发日：

2022.09.16

技术公布日：

2022/12/19