(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010204532.2
(22)申请日 2020.03.21
(71)申请人 张宁坤
地址 100048 北京市海淀区阜成路6号院心
内科
(72)发明人 张宁坤 高连如 陈宇
(51)Int.Cl.
A61D 7/04(2006.01)
A61D 1/00(2006.01)
A61D 3/00(2006.01)
(54)发明名称一种小鼠心肌梗死模型的制作方法(57)摘要本发明公开一种小鼠心肌梗死模型的快速制作 方法，小鼠经诱导麻醉后，呼吸面罩持续麻醉，于左前胸钝性分离胸大肌胸小肌及第3、4肋间打开胸腔，通过术者拇指、食指、中指循环配合操作将小鼠心脏游离端挤出胸腔结扎左心室前降支；本方法制作小鼠心肌梗死模型，未进行气管插管，手术用时30-60秒，胸腔开放时间15-30秒，在关胸时通过术者操作手法挤压出胸腔空气，保持胸腔负压，小鼠自主呼吸无影响，无气胸和呼吸困难，术后脱离麻醉50-90秒即解除抑制中枢神经系统，心肌梗死模型成功率高，死亡率低；本方法缩短了小鼠心肌梗死模型的制作时间，提高大规模使用小鼠心肌梗死模型时实验效 率。权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 111227989 A 2020.06.05
C N 111227989
A
1.小鼠心肌梗死模型的快速制作方法按下列步骤进行，调整麻醉剂异氟烷浓度为异氟烷与氧气的混合气体的
2.5-
3.5%并输入至诱导麻醉箱，将小鼠放入诱导麻醉箱中，1-2分钟小鼠麻醉，调整麻醉剂异氟烷浓度为异氟烷与氧气混合气体的1-2%并输入至小鼠呼吸面罩，将小鼠移至小动物手术台，呼吸面罩罩住小鼠
口鼻，对小鼠进行持续麻醉，用胶带固定小鼠四肢，把小鼠胸部备皮消毒，眼科剪剪开左前胸皮肤1厘米，用镊子和止血钳钝性分离胸大肌和胸小肌，肉眼可见肋骨，止血钳从第三、四肋间穿入胸腔扩开直径0.5-1厘米开口，在小鼠体外术者左手拇指抵住小鼠腹腔左上部，中指弯曲抵住小鼠腹腔右侧上部，食指抵住小鼠胸腔右侧循环挤压小鼠胸腔，待小鼠心尖部位于胸腔开口处时再同时挤压小鼠胸腔，配合止血钳开口大小、方向调整，随着小鼠心脏的自主收缩博动，小鼠心脏游离端即可通过第三、四肋间开口跳出胸腔，使用7-0号手术缝合针线平左心耳下缘进针，深度0.5毫米，向心脏右侧至肺动脉圆椎与心尖部连线处出针结扎前降支，见心脏左心室前壁心肌颜变淡，止血钳从心脏下面探入3-4肋间撑开胸腔开口，随着心脏自主收缩，心脏收回到胸腔，术者左手拇指、食指和中指配合同时挤压胸腔，挤出胸腔中空气，止血钳钳夹第三、四肋骨闭合胸腔开口，将胸小肌复位于第三、四肋间上，胸大肌覆盖于胸小肌之上，胸部皮肤切口两侧钳夹合拢，用6-0号手术缝合针线缝合皮肤切口；术后切口碘伏消毒，撤除呼吸面罩，将小鼠置于37℃动物复温电热毯上，1-2分钟后小鼠苏醒；术后给小鼠做心电图和超声检查，检查小鼠心功能，术后2周处死小鼠，取出心脏检测小鼠心肌组织梗死情况。
2.根据权利要求1所述的小鼠诱导麻醉所使用的异氟烷浓度是异氟烷与氧气混合气体的2.5-
3.5%。
3.根据权利要求1所述的小鼠持续麻醉所使用的异氟烷浓度是异氟烷与氧气混合气体的1-2%。
4.根据权利要求1所述分离胸大肌和胸小肌的方法为钝性分离。
5.在根据权利要求1所述止血钳从第三、四肋间穿入胸腔扩开开口直径为0.5-1厘米。
6.根据权利要求1所述在促使小鼠心脏跳出胸腔时术者挤压胸腔的操作方式是：左手拇指抵住小鼠腹腔左上部，中指弯曲抵住小鼠腹腔右侧上部，食指抵住小鼠胸腔右侧循环挤压小鼠胸腔，待小鼠心尖部位于胸腔开口处时再同时挤压小鼠胸腔，并配合调整止血钳扩开胸腔开口大小和方向。
7.根据权利要求1所述在结扎小鼠心脏左心室前降支时使用7-0号手术缝合针线平左心耳下缘进针，深度0.5毫米，向心脏右侧至肺动脉圆椎与心尖连线处出针结扎左心室前降支。
8.根据权利要求1所述在关闭胸腔时为保证胸腔负压，术者的操作手法是左手拇指、食指和中指配合同时挤压胸腔，挤出胸腔中空气，用止血钳钳夹第三、四肋骨闭合胸腔开口，将胸小肌复位于第三、四肋间上，胸大肌覆盖于胸小肌之上，胸部皮肤切口两侧钳夹合拢，缝合皮肤切口。
9.根据权利要求1所述术后撤除小鼠呼吸面罩，将小鼠置于37℃动物复温电热毯上。
10.根据权利要求1所述制作的小鼠心肌梗死模型符合以下技术特征，术后给小鼠做心电图检查，出现ST段抬高心肌梗死心电图表现，术后2周超声心动图检查小鼠心功能，小鼠左室射分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）比术前减低，左室收缩末内径（LVESD）和舒张末内径（LVEDD）比术前增
加，小鼠心脏左心室前壁心肌厚度（LVAW）比术前减低，所有以上数据
经统计学处理P<0.05为符合心肌梗死特征，术后2周处死小鼠，取出心脏可见小鼠左心室前壁大面积心肌梗死，室壁厚度比正常对照组减低，HE染可见瘢痕组织形成。
一种小鼠心肌梗死模型的制作方法
技术领域
[0001]本发明属于动物实验技术领域，特别涉及一种小鼠心肌梗死模型的快速制作方法。
背景技术
[0002]心肌梗死是心血管疾病中最危急事件，科研人员研究心肌梗死病因、病理等发病机制和研发新的方法和药物是心血管疾病领域的重要研究方向，在心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病基础研究及干细胞移植缺血性心脏病的基础研究中，动物心肌梗死模型被广泛应用，在制作动物心肌梗死模型中可用的动物有猴、猪、狗、兔、大鼠、小鼠等动物，其中小鼠繁殖力强、易于饲养、价格低廉、占用空间少、操作简便，以及小鼠染体在进化的过程中保留了人类同线性基因，小鼠基因在一定程度与人类基因同源性强，因此在基础研究中使用小鼠作为心肌梗死模型动物也更为广泛。
[0003]小鼠心肌梗死模型的制作方法有药物法、微创法、电刺激法、电凝烧灼法、冷冻法、左心室前降支结扎法；药物法是把异丙基肾上腺素经静脉滴注或腹腔注射到小鼠体内，通过药物作用造成冠状动脉痉挛而促使心肌发生梗死，但由于药物的广泛作用、应用的剂量及个体对药物敏感性等差异，该方法所造成的梗死灶则常较为弥散，所制备的心肌梗死模型的病理变化过程也与心肌梗死的病理变化过程存在一定的差异，不便于对心肌梗死面积的后期评价，该方法研究的可靠性也相对较低已经较少使用；微创法是在对动物行冠状动脉造影基础上，经造影管用泛影葡胺把明胶海绵栓子推注到冠状动脉左前降支远端从而栓塞完成模型制作，小鼠由于动脉管径较细而介入操作难度极大，实验成本较高而不宜使用本法；电刺激法是在动物呼吸机辅助下，剪切开胸廓暴露心脏，使用可控微电流刺激血管外膜导致血管内膜受损，激活血小板诱发凝血过程形成血栓导致心肌梗死，因产生的血栓可控性差、引起其他部位产生血栓，并发症多；电凝烧灼法是在动物呼吸机辅助下，剪切开胸廓暴露心脏，应用小高频刀的电灼电极电凝烧灼左心室前降支深部导致心肌梗死，本方法是因超因超高温条件下导致的心肌损伤坏死，而并非心肌缺血性坏死，该造模过程与心肌梗死自然发病过程存在较大差异，烧灼区域炎症反应较为强烈，后期处理步繁杂，且因小鼠胸腔开口较小，小鼠心博较快，操作难度大；冷冻法是在动物呼吸机辅助下，剪切开胸廓暴露心脏，将金属棒置于液氮中数分钟后取出，金属棒顶端触碰小鼠前降支致前降支冻结损伤阻断血流形成心肌梗死，本方法需要开胸伤口较大，炎症反应强，为达到冷冻效果经常要反复冷冻，耗时长，冷冻程度不一、冷冻范围不一，造成心梗模型一致性差，左心室前降支周围心肌损伤大，易造成心律失常。
[0004]左心室前降支结扎法是目前实验中最为常用的心肌梗死造模方法，这种方法可直接造成左心室前降支堵塞，试验周期短，可以观察梗死后对心肌的损害，现有的操作方式是将小鼠麻醉后经口气管插管，机械辅助通气，开胸后在目视下进行左心室前降支结扎，由于小鼠气管狭窄，在经口气管插管时操作困难，且插管与气管壁密封性差，通气效率低，操作耗费较长时间，小鼠开胸后为保证后续小鼠高存活率，胸部开口小，操作视野小，小鼠心脏
在胸腔内跳动次数超过400次每分钟，进针结扎左心室前降支准确度低、费时费力，极容易扎进心室和心房引起大出血而死亡，机械通气时两侧肺部的扩张可达到胸部开口的手术操作区域，在进针时容易引起肺部损伤导致小鼠后续气胸死亡，这种使用呼吸机机械通气辅助呼吸在开胸后直视下进行左心室前降支结扎的操作方式，完成一只小鼠心肌梗死模型制作的时间需要40-90分钟，使用肌肉或腹腔注射麻醉药需要使小鼠麻醉时间至少持续90分钟以上，使用注射麻醉药物长时间持续使小鼠保持麻醉状态严重抑制小鼠中枢神经系统，影响冠状动脉血流状态，手术后不能立即苏醒，体温过底，最终导致小鼠死亡，按此方法进行心肌梗死模型制作时心肌梗死成功率低、小鼠死亡率高，严重影响实验研究的速度和效率；为解决这一问题，急需一种快速制作小鼠心肌梗死模型的方法，优化操作流程，减少操作时间，提高心肌梗死模型成功率，降低小鼠死亡率，有研究者使用心脏挤出法制作小鼠心肌梗死模型，但因不掌握操作方法和合理优化制作流程，导致小鼠心肌梗死模型的成功率低、死亡率高。本研究团队经科研攻关创新研发，优化小鼠麻醉方案、处理心脏方法、结扎关胸方式、1-2分钟恢复小鼠意
识、保持小鼠体温等方法在1分钟时间内制作小鼠心肌梗死模型，心肌梗死成功率高，死亡率低，本发明方法适合进行短期大规模实验所需小鼠心肌死模型制作。
发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种快速制作小鼠心肌梗死模型的方法，克服现有技术操作时间长、小鼠心肌梗死模型成功率低、死亡率高的不足，优化在制作小鼠心肌梗死模型中多种影响因素，缩短制作小鼠心肌梗死模型时间的方法，提高小鼠心肌梗死模型的制作成功率和存活率。
[0006]小鼠心肌梗死模型的快速制作方法按照下述操作步骤进行：
步骤1，用气体流量管连接好氧气瓶、麻醉机、气体分流器、麻醉诱导箱、小鼠呼吸面罩，调整麻醉机参数使异氟烷占异氟烷和氧气混合气体的浓度为3%，这个浓度为诱导麻醉模式的浓度，打开麻醉气体通路上的分流器使异氟烷与氧气的混合气输入至诱导麻醉箱，在诱导麻醉箱中放入小鼠，1-2分钟小鼠即麻醉，针刺小鼠皮肤小鼠无任何反应，调整麻醉机参数使异氟烷占异氟烷和氧气混合气体的浓度为1.5%，这个浓度为持续麻醉模式的浓度，再打开分流器调整流量使异氟烷与氧气的混合气体等量持续输入至诱导麻醉箱和小鼠手术台呼吸面罩，将在诱导麻醉箱中已经麻醉的小鼠从诱导麻醉箱中取出，把小鼠的口鼻放入小鼠手术台上呼吸面罩内使小鼠持续麻醉，小鼠仰卧在手术台，四肢用胶带固定，进入下一步工序。
[0007]步骤2，作为优化，脱去小鼠胸部毛，用碘伏消毒已脱毛的胸部皮肤，用10cm手术剪在胸骨左侧第3-4肋间胸大肌前沿剪开皮肤1厘米，用摄子夹住皮肤，止血钳在皮肤下分离胸大肌与皮肤，再用镊子夹住胸大肌，止血弯钳探入胸大肌下夹住胸小肌进行两者钝性分离，分离胸大肌和胸小肌无剪切损伤，目视下见到第3、4肋骨，止血弯钳通过3-4肋间探入胸腔，钝性分开第3、4肋骨间隙开口为0.5-1厘米，术者左手拇指在小鼠体外抵住小鼠腹腔左上部，术者左手中指弯曲抵住小鼠腹腔右侧，术者左手食指抵住小鼠胸腔右侧轻轻用力先循环挤压胸腔，待见到心尖部位位于胸腔开口处时再同时挤压胸腔，配合止血钳在左胸第3-4肋间开口大小和方向的调整，随着心脏的自主收缩博动，小鼠心脏游离端通过3-4肋间
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