(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710934345.8
(22)申请日 2017.10.10
(71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号
(72)发明人 刘龙 姜竹 陈坚 堵国成
李江华
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 张勇
(51)Int.Cl.
C12N 15/55(2006.01)
C12N 9/80(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12P 19/26(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种重组大肠杆菌全细胞转
本发明首先构建了一株异源表达几丁二糖脱乙
(GlcNAc)为底物，
通过重组菌全细胞催化生产N-氨基葡萄糖。具有低生产成本、生产条件温和、转
化体系中杂质较少、工艺步骤简单、生产操作安
全等优点。采用本发明生产的N-氨基葡萄糖产量
高，以113mM/L N-乙酰氨基葡萄糖为底物，N-乙
酰氨基葡萄糖的转化率最高可达96.
65％。权利要求书1页 说明书5页序列表4页 附图3页CN 108070604 A 2018.05.25
C N 108070604
A
1.一种生物法生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，以几丁二糖脱乙酰酶或产几丁二糖脱乙酰酶的细胞为催化剂，转化N -乙酰氨基葡萄糖生产氨基葡萄糖；所述几丁二糖脱乙酰酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产几丁二糖脱乙酰酶的细胞为表达SEQ ID NO.1所示几丁二糖脱乙酰酶的重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化是以50～200mmol/L的N -乙酰氨基葡萄糖为底物，在30-90℃，pH 5.0-11.0的条件下，转化0.5-20h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化是在细胞终浓度为10.6～47.9g/L的反应体系中转化。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化是在pH 7.0-10.0，4-45℃的条件下转化4-20h。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌产几丁二糖脱乙酰酶；所述几丁二糖脱乙酰酶的含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET -28a(+)为表达载体。
8.一种构建权利要求7所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，在大肠杆菌中表达。
9.权利要求1-5任一所述的方法在制备含有氨基葡萄糖的产品中的应用。
10.权利要求6或7所述的重组大肠杆菌在食品领域的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108070604 A
一种重组大肠杆菌全细胞转化生产氨基葡萄糖的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种重组大肠杆菌全细胞转化生产氨基葡萄糖的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
[0002]氨基葡萄糖(GlcN，2-氨基2-脱氧-葡萄糖，CAS 3416-24-8)是一种天然的氨基糖，是葡萄糖的一
个羟基被氨基取代后的化合物，是合成氨基聚糖的基本物质，同时也是一种糖蛋白的成份，是人体和动物的天然成分的联合组织，此外，也是重要的很多生物反应前体物质。氨基葡萄糖硫酸盐是当今世界上认可度较高的一种有效降低骨关节炎发病率的药品、当作为膳食营养补充剂时能有效的减缓骨关节炎症。在美国被列为食品补充剂而广泛使用。氨基葡萄糖硫酸盐在EULAR指南中，作为至高证据等级的推荐药品。
[0003]目前氨糖生产方法主要为甲壳素水解法，该方法在原料来源、环境保护以及产品安全方面存在诸多潜在问题。此外，微生物发酵法生产氨糖也有相关报道，但依然存在产量低，菌体对氨糖不耐受的情况。因此微生物发酵法生产氨糖依然存在诸多问题，限制其在工业生产中的应用。目前已有多篇报道表明，可以利用微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖，如枯草芽孢杆菌及大肠杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖。在该方法中，微生物代谢合成N-乙酰氨基葡萄糖后，需采用酸水解法将N-乙酰氨基葡萄糖酸解成氨基葡萄糖，该过程需引入过量酸试剂，容易造成设备损耗，产生严重环境污染，且产率低，难用于生产实践和工业化大规模生产。目前市场上存在的脱乙酰酶，多是针对乙酰氨基葡萄的寡聚体或多聚体形式进行作用而针对乙酰氨基葡萄糖单体形式存在的脱乙酰酶鲜有报道。因此，目前市场上存在可以高效生产乙酰氨基葡萄糖的方法，而缺少一种高效的，环境友好的生产氨糖的方法。[0004]几丁二糖脱乙酰酶(Diacetylchitobiose Deacetylase)，该酶不仅对几丁二糖有活性，对氨糖单体也有很高活性，在极端嗜热古菌属中几丁质的代谢途径中有重要作用，可以催化从几丁二糖的非还原性末端
先脱去乙酰基，从而生成非还原性末端部分脱乙酰化的GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的作用下生成GlcN和GlcNAc，随后，几丁二糖脱乙酰酶再催化 GlcNAc脱乙酰生成GlcN。几丁二糖脱乙酰酶来源于极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii OT3)，具有极强的耐热性和良好的热稳定性，但极端嗜热古菌的生长条件要求苛刻，培养成本昂贵，难以大规模生产，因此，生产工艺简单、绿环保且高效的氨基葡萄糖生产方法亟待开发。
发明内容
[0005]本发明旨在开发一种新的全细胞转化GlcN的生产模式，该生产方法操作简单，一步到位，易于控制，反应条件温和，对设备要求较低。在反应过程中无需引入有毒的化学原料，反应所需底物、培养基及产物对环境不会造成污染，相较于酸水解法生产GlcN，操作简单，成本低，污染小；相较于目前市场上的酶法生产，步骤简单，无需经过酶的分离及纯化等步骤，对反应对底物的专一性高。因此，全细胞转化法生产的GlcN，产物纯度高，易于分离纯
化，有利于大规模的工业化应用。
[0006]本发明的第一个目的是提供一种生物法生产氨基葡萄糖的方法，打破目前工业上生产 GlcN的技术瓶颈，通过产几丁二糖脱乙酰酶的基因工程菌全细胞转化N-乙酰氨基葡萄糖生产氨基葡萄糖。
[0007]在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是表达极端嗜热古菌来源的几丁二糖脱乙酰酶基因的重组大肠杆菌。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌表达SEQ ID NO.1所示的几丁二糖脱乙酰酶。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是以50～200mmol/L的N-乙酰氨基葡萄糖为底物，在30-90℃，pH 5.0-11.0的条件下，转化0.5-20h。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是在pH 7.0-10.0的条件下转化。[0011]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是在细胞终浓度为10.6～47.9g/L 的条件下转化。
[0012]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是在4-45℃的条件下转化。[0013]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是在4-20h内转化。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是以100～150mmol/L的N-乙酰氨基葡萄糖为底物，在4-45℃，pH 7.0-10.0的条件下，转化8-20h。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是在37℃培养至OD600为0.5～0.8时，加入IPTG诱导后进行全细胞转化。
[0016]本发明的第二个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达极端嗜热古菌 (Pyrococcus horikoshii)来源的几丁二糖脱乙酰酶。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述几丁二糖脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0018]在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以 pET-28a(+)为表达载体。
[0019]本发明的第三个目的是提供所述重组大肠杆菌的构建方法，是将SEQ ID NO.2所示基因在大肠杆菌中表达。
[0020]在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以 pET-28a(+)为表达载体。
[0021]本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌的应用。
[0022]在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含有氨基葡萄糖的产品。[0023]本发明的有益效果：
[0024]本发明成功实现了Pyrococcus horikoshii OT3来源的几丁二糖脱乙酰酶在大肠杆菌中的异源表达，
并以此重组细胞实现了一步转化N-乙酰氨基葡萄糖生产N-氨基葡萄糖。与现有技术相比，本发明的全细胞转化N-乙酰氨基葡萄糖生产N-氨基葡萄糖的方法，操作简单，一步到位，易于控制，反应条件温和，对设备要求较低，产物得率高，而生产周期短，在8h内可能利用98.65％的底物。本发明技术方案缩短了生产周期，降低了生产成本，在反应过程中无需引入有毒的化学原料，反应所需底物、培养基及产物对环境不会造成污染。工艺流程简单，无需经过酶的分离及纯化等下游工艺步骤。因此，全细胞转化法生产的GlcN，
目前尚未有利用全细胞转化法生产GlcN的报道。此法克服现有技术的缺陷，采用生物法代替化学酸解法，打破目前工业上生产GlcN的技术瓶颈，生产成本低，工艺流程简单，易于控制，方便推广，使GlcN的大规模工艺生产成为可能。采用本发明的方法可以使转化率在113mmol/L GlcNAc的底物中最高达96.65％。
附图说明
[0025]图1重组质粒的构建图；
[0026]图2全细胞转化优化结果图：A，pH值对全细胞转化的影响；B，细胞添加量对全细胞转化的影响；C，底物乙酰氨基葡萄糖对全细胞转化的影响；D，温度对全细胞转化的影响。
具体实施方式
[0027]菌株和载体：
[0028]质粒的复制采用大肠杆菌(Escherichia coli JM109)为宿主菌，脱乙酰酶的表达及菌株发酵采用大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))。实验使用的质粒pET-28a(+)购自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)。
[0029]试剂、酶及相关试剂盒：
[0030]抗生素(硫酸卡那霉素)购自于上海生工有限公司。各种化学试剂均为分析纯，购自于上海国药集团。各种限制性内切酶和DNA连接酶购自于Takara公司。1kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒购自于上海生工有限公司。胶回收试剂盒购自于Fermentas公司。[0031]本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。
[0032]种子培养基(每100mL含有)：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g。
[0033]发酵培养基(每100mL含有)：蛋白胨4g，酵母粉2g，NaCl 4g。
[0034]HPCL待测样品制备：取1mL反应液，离心去除反应中沉淀，取适量上清液，用去离子水进行适当稀释后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。滤液供高效液相谱分析。
[0035]氨基葡萄糖的含量测定：Agilent 1260高效液相谱仪(配紫外可见检测器)采用A g i l e n t O D S(250m m×4.6m m，5μm)谱柱；衍生试剂为O P A(邻苯二甲醛，o-phthaldialdehyde) 流动相A配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。流动相B：配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至 200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL 甲醇，混合后备用。流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。梯度洗脱。紫外检测器在检测波长为338nm下进行检测。
[0036]GlcNAc转化率的计算：GlcNAc转化率(％)＝(M1-M2)/M1×100
[0037]GlcN生成率的计算：GlcN转化率(％)＝M3/M1×100
[0038]其中，M1为催化反应前GlcNAc的摩尔质量，M2为催化反应结束后剩余的GlcNAc的摩尔质量，M3为催化反应过程中生成的GlcN的摩尔质量。
[0039]GlcNAc反应速率的计算：GlcNAc反应速率＝(C1-C2)/T
[0040]GlcN反应速率的计算：GlcN反应速率＝C3/T
[0041]其中，C1为催化反应前GlcNAc的浓度，C2为催化反应结束后GlcNAc的浓度，C3为催
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议