土壤中放线菌的分离纯化和染
实验方案
一、实验目的
1.掌握放线菌的分离纯化及染的基本流程；
3.复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方法以及接种技术；
4.学会使用高压蒸汽灭菌锅、培养箱、超净工作台、显微镜等实验仪器设备；
5.培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料
1、实验仪器
培养箱、超净工作台、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、分析天平、接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液、剪刀等其它常规的实验仪器 2、实验耗材
擦镜纸、吸水纸、标签纸、无菌称量纸、无菌水、蒸馏水
3、实验药品
草酸铵结晶紫、番红、95%酒精、碘液、可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、重铬酸钾
4、实验材料
土壤
四、实验步骤
1、土壤取样
在实验前，取学校体育馆附近树木下10~20㎝土壤作为土样。
2、培养基的配制
高氏一号培养基（分离和培养放线菌）：可溶性淀粉 2.0g 硝酸钾0.1g 磷酸氢二钾0.05g 氯化钠0.05g 硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g 琼脂2g 水100ml
先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。
3、仪器灭菌
将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好以及玻璃珠、试管、三角锥瓶、载玻片、盖玻片放到高压灭菌锅内进行高温蒸汽灭菌。
4、制备土壤稀释液
（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。
振荡20-30min，使样品中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。
（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）
①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.
②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，分别将土壤悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的土壤稀释液。
5、稀释涂布法分离土壤中放线菌
将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令
三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。
（3）涂布平板
用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。
（4）倒置平板
将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d
6、放线菌的纯化
（1）倒平板 同上
（2）平板划线
将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。
7、放线菌的观察
玻璃纸法
（1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。
（2）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。
（3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。
（4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。
（5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用
无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。
8、放线菌保藏
斜面低温保藏法
将纯化培养后的放线菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 个月，移种一次。
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