一． 实验目的
了解纤维素降解菌的分离流程，并掌握分离方法。了解生物技术在环境污染治理中的应用，掌握环境生物技术研究的基本方法。
二．实验原理
纤维素是自然界中存在的最廉价、最丰富的天然可再生资源,存在许多高能氢键, 因此其水解、利用较困难,利用微生物分解纤维素能够节省资源又减少对环境造成的污染。纤维素是碳源营养物质，已知的分解纤维素的真菌有野生型的曲霉、青霉、木霉等，细菌有纤维素单胞菌、纤维弧菌，在有氧条件下起分解纤维素作用的主要是真菌。纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前
两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
多聚糖与刚果红形成多聚糖——刚果红复合物。复合物不仅被吸附在菌丝外，而且可以进一步被吸收转化到菌丝内部。通过进一步的降解，多聚糖被进一步吸收利用。而刚果红被留在菌丝外使菌落显红。纤维素降解菌首先分解的纤维素物质为含有葡聚糖等物质的多聚糖类物质。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 三．实验材料
刚果红培养基 (K2HPO4 0.5g CMC-Na 1.88g MgSO4•7H2O 0.25g 明胶 2g 刚果红 0.2g 琼脂 14g）土壤 小烧杯 培养皿 蒸汽灭菌锅 锥形瓶 涂布器 无菌操作台 移液 滴管 头 试管 培养箱 无菌称量瓶 药匙 试管架 四．实验过程
1．取土壤
取表层以下5—10cm处的土样(注意取土的位置，应选择富含纤维素的环境，在植物茂盛的地方。），放入小烧杯中备用，或放在4℃冰箱中暂存。参考文献（沈萍、范秀容、李广斌，微生物学实验（第三版）北京：高等教育出版社，2001）
2．制备稀释液(要无菌操作)
(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1)。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
参考文献（黄秀梨主编，微生物学实验指导，北京：高等教育出版社，施普林格出版社）
3.灭菌
在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20m。将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。
4.涂布
涂布平板：将稀释度为10-4～10-6的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。完成后贴好标签。
5.培养观察
放入培养箱中（28——30摄氏度）倒置培养一周，拿出观察是否有透明圈出现。参考文献（《微生物学实验指导》作者：黄秀梨 辛明秀 叶姜瑜 一种纤维素分解菌鉴别培养基 微生物通报，1997，24（4）：251～252）
五．注意事项
1．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
3．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
4. 把握好培养时间及培养温度。
应用微生物技术实验设计
班级 A14制药
姓名 赵国雨
学号 140513101
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