微⽣物的纯培养、分离纯化与平板计数
⼀．实验⽬的
1.了解微⽣物纯培养的⽬的与⽅法。
2.掌握分离纯化微⽣物的⼏种⽅法。
⼆．实验原理
1.微⽣物纯培养的原理
⾃然界中各种微⽣物混杂⽣活在⼀起，即使取很少量的样品也是许多微⽣物共存的体。⼈们要研究某种微⽣物的特性，⾸先须使该微⽣物处于纯培养状态。也就是说培养物中所有细胞只是微⽣物的某⼀个种或株，它们有着共同的来源，是同⼀细胞的后代。使⽤显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，纯培养物通常是通过⼈⼯培养⽅法获得的。获得纯培养物的关键有两点：（1）所有相关物品必须是⽆菌的。（2）分离单个微⽣物细胞并将其培养成⼀个体。
2.分离纯化微⽣物的⼏种⽅法
从混杂的微⽣物体中获得只含有某⼀种或某⼀株微⽣物的过程称为微⽣物的分离与纯化。混合样品的分离⽅法包括两⼤步骤，使菌体浓度得到稀释使微⽣物的细胞或孢⼦以单独的状态存在，在适宜条件下形成菌落。如果将其接种到适当的培养基上就得到了纯种的微⽣物。 分离纯化微⽣物的⽅法包含两类：⼀是达到菌落⽔平，另⼀类是达到细胞⽔平。菌落分离纯化⽅法包括：平板划线法，平板涂布法和倾注分离法。细胞分离纯化⽅法包括：单孢分离法和菌丝顶端切割法。平板划线法，平板涂布法和倾注分离法因⽅法简便、设备简单分离效果良好⽽被⼴泛使⽤。
（1）平板划线法原理：当通过划线法分离微⽣物时，培养物在固体培养基上通过划线被稀释。划线的⽬的是使细菌细胞间的空间⾜够⼤，这样单个细胞繁殖所产⽣的⼤量后代就会形成⼀个菌落。由此可见，菌落就是在固体培养基表⾯由单个微⽣物繁殖形成的⾁眼可见的细胞集团，菌落也可以是由⼀同类微⽣物繁殖形成。挑取但菌落进⾏扩⼤培养就是纯培养。
（2）平板涂布法原理：将经过适当稀释的⼀定体积的菌液加到已凝固的平板培养基表⾯，然后⽤⽆菌涂布器速将其涂布均匀，如果涂布适宜，经培养后，在平板表⾯可以得到但菌落，从⽽达到离纯化微⽣物的⽬的。平板涂布法还可以⽤于微⽣物平板菌落计数。 （3）倾注接种法原理：将待分离培养的菌液经过适当的稀释后，取合适稀释度的少量菌液加到⽆菌平⽫中，然后加⼊融化并冷却⾄50℃左右的培养基，充分混匀，待凝固，在适宜温度下培养⼀段间，如果稀释得当，经培养后，可以从平板表⾯或内部长出单落，从⽽达到离纯化微⽣物的⽬的。倾注接种法也常⽤于微⽣物平板菌落计数，如⽔或⽜奶的活菌数测定。
在平板涂布法和倾注接种法中，平板涂布法⽐较适合于好氧细菌和有⽓⽣菌
丝的放线菌的分离，⽽倾注接种法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离。
3.平板计数原理：
稀释平板计数法是⼀种最常⽤的活菌计数法。其依据是微⽣物在⾼度稀释的条件下，在固体培养基上形成的⼀个菌落是由⼀个单细胞繁殖形成的，因此⼀个菌落形成单位代表⼀个细胞。在计数的时候，⾸先将待测样品进⾏系列稀释，使待测样品中的微⽣物细胞成单个细胞存在，再取⼀定量的稀释液接种到固体培养基中（平板接种培养有两种⽅法：平板涂布法和倾注接种法，我们使⽤的是平板涂布法）
，使其均匀地分布于培养基的表⾯或内部（倾注接种法），经适宜培养后，单个细胞⽣长繁殖形成菌落，计数菌落数⽬，即可换算出样品中的含菌数⽬。
平板菌落技术法常⽤语⽣物制品的检验、⼟壤含菌量的测定以及⾷品、⽔源的污染程度的检验等。
三．实验材料
1. 菌种：⼤肠杆菌菌液。
2. 培养基：LB固体培养基。
3. 仪器：⽆菌涂布器、⽆菌吸管6⽀、接种环、⽆菌培养⽫、5⽀盛有
4.5mL ⽆菌⽔的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、马克笔。
四．实验步骤
1.涂布平板法
（1）培养⽫、吸管和试管编号：取6只⽆菌的培养⽫，分别标号10-3、10-4、
10-5 三种稀释度，各两⽫（标准操作为每组三个⽫，此处只为练⼿⽤两个⽫）。将5只试管分别标注1,2,3,4,5表⽰稀释倍数。将6只吸管分别标记1,2,3,4,5,6，以⽅便吸取菌液。
（2）制备⽆菌平板：点燃酒精灯，将融化并冷却⾄50℃左右的培养基（⼿触摸不烫⼿）倒⼊⽆菌培养⽫中，倒的时候右⼿握住三⾓瓶的瓶⾝或者是瓶底，不要握住瓶⼝，因为倒平板时要先将瓶⼝加热，⽤⼿握住瓶⼝容易烫伤并且也握不稳。操作过程中要⽤左⼿⾷指和⼤拇指拿稳⽫盖，剩下三个指头拖住⽫⾝，使其尽量⽔平在酒精灯附近操作。倒平板的时候⼤约每个倒
15~20ml，太少了涂平板时容易涂破，太多了造成浪费。倒完后将培养⽫盖上平⾏沿着桌⾯慢慢推向桌⼦⾥⾯。平置待凝。（3）稀释菌液：。取5⽀盛有4.5mL⽆菌⽔的试管，稀释倍数依次为10-1、
10-2、10-3、10-4、10-5。⽤1ml⽆菌吸管（看清吸管的量程）吸取0.5mL已充分混匀的⼤肠杆菌菌液（待测样品），放⾄装有4.5ml⽆菌⽔带有标记1的试管中，此即为10倍稀释。将10-1稀释的试管振荡使菌液充分混匀。另取⼀⽀1mL⽆菌吸管插⼊1号试管中吸取10-1已充分混匀的菌液0.5ml，放⾄装有4.5ml⽆菌⽔带有标记2的试管中，此即为100倍稀释。依次类推，直⾄最后⽤吸管吸取10-5菌液0.5ml放⾄装有4.5ml⽆菌⽔5号标记的试管中，此即为105倍稀释。（取菌液时按照由1号到5号吸管的顺序分别取液，其中4号吸管⽤于吸取10-3的菌液，5号吸管⽤于吸取10-4的菌液，6号吸管⽤于吸取10-5的菌液）
（4）加菌液并涂布均匀：稀释完菌液后，固体培养基已经冷凝，分别⽤4,5,6
号吸管吸取10-3、10-4、10-5稀释的菌液各0.2ml,⼩⼼地滴在平板培养基表⾯中央位置加于相应编号的⽆菌培养⽫中，⽤⽆菌涂布器在培养基表⾯轻轻地涂布均匀（顺序：先涂低浓度再涂⾼浓度，这样不⽤洗涂布器），使菌液均匀铺满整个培养⽫表⾯。（⽤涂布器之前要现在酒精灯上烤⼀烤，待冷却后再涂布）
（5）培养：将冷凝的固体培养基倒置于37℃温室中培养24～48h。（此步骤之前培养基均正向放置）
2.平板划线法
（1）培养⽫的标记：将⾃⼰的培养⽫做好标记。
（2）制备⽆菌平板：⽅法同上“涂布平板法”。
（3）划线。在近⽕焰处，左⼿拿培养⽫，拿⽫⽅法同上“涂布平板法”，右⼿拿接种环，挑取⼤肠杆菌菌液⼀环在平板上划线。（划线之前将接种环环⼝在酒精灯上烤到红热后再来回烤烤铁丝环⾝，冷却⼀段之间蘸取菌液划线），⽤接种环蘸取⼤肠杆菌菌液，先在平板培养基的⼀边作第⼀次平板划线，连续划⼏个来回的平⾏弧线（可以不⽤取很多菌液，因为第⼀次划线菌液浓度很⼤），再转动培养⽫约70度，在酒精灯上灼烧接种环上剩余物，待冷却后通过第⼀次划线部分作第⼆次平⾏划线，再⽤同
样的⽅法通过第⼆次划线部分作第三次划线和通过第三次平⾏划线部分做第四次平⾏划线（第四次划线时可以不⽤酒精灯再烤接种环了，因为第三次划线时浓度已经很⼩，第四次划线尽可能地将菌落划开）。通过划线将样品在平板上进⾏稀释，使之形成单个菌落。
（4）培养：将冷凝的固体培养基倒置于37℃温室中培养24～48h。（此步骤之前培养基均正向放置）
注：涂布平板法和平板划线法获得的单个菌落均可作为单克隆进⾏纯培养。
3.涂布平板计数法
从培养箱中取出培养⽫，分别在-3、-4、-5倍稀释的培养⽫中计单个菌落的数⽬，以平均值得到最后的结果。分别计算稀释的菌液⾥1ml菌液所含菌的数量。
五．实验结果
1.在平板划线法得到的菌落中可见第⼀次划线和第⼆次划线得到的菌落（由于
培养时间⽐较短，没有得到四次划线的结果），第⼀次划线的菌落密集，第⼆次划线的菌落稀疏，可以观察到单个菌落（图1）。
2.在涂布平板计法中所见到的三种密度的菌落中-3倍稀释得到的菌落密度最低
（图2），-4倍其次（图3），-5倍最⾼。通过平板计数得到0.2ml 10-3的菌液在37℃温室中培养48h后，形成了680个单菌落。那么1ml10-3的菌液在37℃温室中培养48h后，能形成3400个单菌落。
图1图2 图3
六．问题与讨论
1.⽤棉花塞吸管的时候不能塞得太紧，也不要塞得过松。塞得太松灭菌效果不
好，如果塞得太紧，灭完菌后，再⽤的时候不容易吸⼊和吹出液体。我们组灭菌的六只吸管就有⼀只由于塞棉花塞得太紧吸菌液吸不上来。
2.每⼀⽀吸管只能接触⼀个稀释度的菌悬液。否则稀释不精确。
3.⼀般同⼀稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误
差。此实验为了节约时间和试剂每组只⽤了⽤两个⽫。
4. 凡是⽆菌操作都应该在酒精灯附近进⾏。
5. ⽤三⾓瓶到平板的时候右⼿握住三⾓瓶的瓶⾝或者是瓶底，不要握住瓶⼝，
因为倒平板时要先将瓶⼝加热，⽤⼿握住瓶⼝容易烫伤并且也握不稳。操作过程中要⽤左⼿⾷指和⼤拇指拿稳⽫盖，剩下三个指头拖住⽫⾝，使其尽量⽔平在酒精灯附近操作。
6. 倒平板的时候⼤约每个倒15~20ml，太少了涂平板时容易涂破，太多了造成浪
费。
7. 倒完平板后，将培养⽫盖上平⾏沿着桌⾯慢慢推向桌⼦⾥⾯，以保证LB固体
培养基在冷凝过程中表⾯能够保持⽔平，利于之后涂平板操作。
8.⽤⽆菌吸管时，⼀定要看清吸管的量程，是1ml还是10ml。本次实验很多同
学都把1ml的吸管当作是是10ml的吸管了，导致加样过程中造成了许多⼈为误差。
9. 取菌液时按照由1号到5号吸管的顺序分别取液，其中4号吸管⽤于吸取10-3
的菌液，5号吸管⽤于吸取10-4的菌液，6号吸管⽤于吸取10-5的菌液。本次实验数的菌液偏多就是因为⽤的3号吸管⽤于吸取10-3的菌液，4号吸管⽤于吸取10-4的菌液，5号吸管⽤于吸取10-5的菌液。造成误差的原因是：原本取样时，1号吸管吸取的是原液，2号吸管吸取的是10-1倍稀释液，3号吸管吸取的是10-2稀释液，⽽我们组加样时却⽤了3号吸管吸取了10-3稀释液，以此类推，导致我们的实验结果都偏⼤了。
10.涂布平板法涂布时，先涂低浓度菌液再涂⾼浓度菌液，这样不⽤每次涂完后
再清洗涂布器，节省时间。
11.平板划线法涂布之前，要将接种环环⼝在酒精灯上烤到红热状态，防⽌杂菌
污染。
12. 平板划线法涂布时，由于第⼀次划线菌液浓度很⼤，可以不⽤取很多菌液，
如果取了过多菌液，则难以形成单菌落。
13.在第四次划线时可以不⽤酒精灯再烤接种环，因为第三次划线时浓度已经很
⼩，第四次划线很容易形成单菌落。
14.⽆论是涂布平板法还是平板划线法，涂布时都应该注意在特定的时候要应在
酒精灯上来回烤涂布器和接种环，防⽌杂菌污染。
15.在将培养⽫放⼊培养箱之前，培养基均正向放置。放⼊培养箱之后，培养基
要倒置，防⽌培养⽫⽫盖上的⽔蒸⽓形成⽔珠脱落在培养基上，造成菌落漂浮移动，不易形成单菌落。七．参考⽂献
1.徐威，2014，微⽣物学实验。
2.沈萍，范秀容，李⼴武，1999，微⽣物学实验
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