土壤微生物的分离与平板菌落计数实验二土壤微生物的分离与平板菌落计数 一、实验目的
(1)几种常用分离纯化微生物的基本操作技术
(2)掌握倒平板
(3)学习平板菌落计数的基本原理和方法
二.实验原理
微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。分离纯化微生物的常用方法有平板表面画线法、平板表面涂布法和琼脂培养基浇注法等，因为其方法简单、设备简单、分离效果好，所以一直被实验室普遍选用。 活菌计数的基本方法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
三.实验器材
1.材料：土壤
2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基
3.仪器或其他用具：无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱
四.实验步骤
(一)采样
取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 ?冰箱中暂存。
(二)倒平板(无菌操作)
培养基加热溶化，待冷至55-60? ，然后在无菌操作条件下倒入培养基于无菌培养皿中，并在各培养皿上作好标记。
(三)制备土壤稀释液(无菌操作)
1.制备土壤悬液
用电子天平称取 5g土于装有45ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min，使土壤与水充分混匀
2.梯度稀释
取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。
(四)平板分离单菌落(无菌操作)
选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌的土壤悬液，在酒精灯旁进行划线操作，用左手控制培养皿，右手捏接种环，在标记处划3-4条连续的平行线作当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。将烧去残余菌样后的接种环在平板培养基边缘冷却以下，然后将培养基另一区转至划线位置，将接种环通过菌源区而移至现在的划线区，依次类推划上几次。然后烧去接种环上的残菌。最后平板倒置，恒温培养：细菌培养37?，1-2d；放线菌培养28?，5-7d；霉菌培养28?，3-5d。
(五)活菌计数
从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各管中，分别吸出1ml菌液加至相应编号的平板表面上。用左手控制培养皿，并将皿盖开启一缝，右手拿涂布玻璃棒把培养皿上的一滴菌液轻轻涂开、均匀铺满整个平板，并防止平板培养基破损。最后平板倒置，恒温培养：细菌培养37?，1-2d；放线菌培养28?，5-7d；霉菌培养28?，3-
5d。
经培养后，选出菌落数在30-300个/皿范围内的各培养皿，计算每皿的菌落数，并记录结果。
五、实验结果
(1)涂布平板法
在10-4浓度时，经培养得到椭圆或圆形的无单菌落，目测输出的结果是26个单菌落。
10-6 10-5 10-4 10-3
第一组 2 2 26 70
第二组 3 1 7 150
第三组 0 1 14 110
平均数 1.7 1.3 15.7 110 涂布平板法得到的结果如上表所示，随着浓度的降低，单菌落数也呈降低趋势，
-
5，10-6时出现增加趋势，可能是由于实验误差造成的(计数误差；吸但在10 取土壤菌液不准确；外界污染带入菌)
(2)平板划线伐
平板划线法得到一个单菌落，并且此单菌落长在所划线上，结果较理想。
六、实验作业
1.用平板划线法进行纯种分离的原理是什么，有何优点,
答：平板划线法进行纯种分离的原理是：在固体培养基表面将含菌培养物做规则划线，含菌样品经多次划线逐步被稀释，最后在接种针划过的线上得到一个被分离的单独存在的细胞，经过培养后形成彼此独立的由单个细胞发育的菌落。其优点是：操作简单，而且在分离微生物的同时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
2 .试比较浇注平板法和涂布平板法的优点和应用范围
浇注平板法涂布平板法
优点培养基的表面和内层均能可防止一些严格好氧菌因被固定在琼脂中生长菌落间缺氧而影响其生长
使培养基能被充分利用
缺点使某些好氧菌因缺氧死亡未充分利用培养基
应用范适合兼性厌氧的细菌和酵适用于好氧性或有气生菌丝的放线菌和细围母菌的分离菌的分离
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