08202 刘陶 於然
关键字：氨基糖甙碱性化合物 链丝菌素 硫酸链霉素 毒性反应 合成基因簇 次级代谢 物 引言：链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸。链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病的新纪元。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。 链霉素的发展历史
1945年，弗莱明、弗洛里、钱恩三人分享诺贝尔医学奖，这是为了表彰他们发现了有史以来第一种对抗细菌传染病的灵丹妙药——青霉素。但是青霉素对许多种病菌并不起作用，包括的病原体结核杆菌。是对人类危害最大的传染病之一，在进入20世纪之后，仍有大约1亿人死于，包括契诃夫、劳伦斯、鲁迅、奥威尔这些著名作家都因而过早去世。世界各国医生都曾经尝试过多种的方法，但是没有一种真正有效，患上结核病就意味着被判了死刑。即使在科赫于1882年发现
结核杆菌之后，这种情形也长期没有改观。青霉素的神奇疗效给人们带来了新的希望，能不能发现一种类似的抗生素有效地？
果然，在1945年的诺贝尔奖颁发几个月后，1946年2月22日，美国罗格斯大学教授赛尔曼?瓦克斯曼（Selman A. Waksman）宣布其实验室发现了第二种应用于临床的抗生素——链霉素，对抗结核杆菌有特效，人类战胜结核病的新纪元自此开始。和青霉素不同的是，链霉素的发现绝非偶然，而是精心设计的、有系统的长期研究的结果。和青霉素相同的是，这个同样获得诺贝尔奖的发现，其发现权也充满了争议。
瓦克斯曼是个土壤微生物学家，自大学时代起就对土壤中的放线菌感兴趣，1915年他还在罗格斯（Rutgers）大学上本科时与其同事发现了链霉菌——链霉素就是在后来从这种放线菌中分离出来的。人们长期以来就注意到结核杆菌在土壤中会被迅速杀死。1932年，瓦克斯曼受美国对抗结核病协会的委托，研究了这个问题，发现这很可能是由于土壤中某种微生物的作用。1939年，在药业巨头默克公司的资助下，瓦克斯曼领导其学生开始系统地研究是否能从土壤微生物中分离出抗细菌的物质，他后来将这类物质命名为抗生素。
链霉素的生产制备
链霉素由灰链霉菌发酵生产。双
氢链霉素可由湿链霉菌产生，但通常以半合成方法生产由灰链霉菌产生的广谱抗生素，分子由链霉胍、链霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺组成。链霉素分子中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，其抗菌效能与链霉素大致相同，但对听觉神经的毒性比链霉素大。[1]由于链霉素生物合成中间体较难分离和测定，链霉素生物合成基因簇经历了比较复杂的生物化学和遗传学研究过程，现在对其生物合成基因簇已有大致的了解。链霉素的抗性基因与生物合成基因紧密连锁，strA基因编码链霉素-6'-磷酸酶，strK编码链霉素-6-或-3"-磷酸化酶，strR基因是一个组成型正调节基因。参与氨基环醇（链霉胍）的生物合成基因有青蟹-肌醇胺-4-磷酸脒基转移酶基团，N-脒基链霉胺-6-磷酸脒基转移酶基因，青蟹-肌糖脱氢酶基因，N-脒基-链霉胺-6-磷酸转移酶基因，D-肌-肌醇-3-磷酸化酶基因，青蟹-肌醇胺-4-磷酸转移酶基因，3-酮-N-脒基-青蟹-肌醇胺氨基转移酶基因，N-脒基-青蟹肌醇胺脱氢酶基因。[2] 生产过程分为两大步骤：①菌种发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱得到精制液。精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产
品，或者将浓缩液直接做成水针剂。[3]链霉素是由瓦克斯曼的学生阿尔伯特萨兹（Albert Schatz）分离出来的。1942年，萨兹成为瓦克斯曼的博士研究生。不久，萨兹应征入伍，到一家军队医院工作。1943年6月，萨兹因病退伍，又回到了瓦克斯曼实验室继续读博士。萨兹分到的任务是发现链霉菌的新种。在地下室改造成的实验室里没日没夜工作了三个多月后，萨兹分离出了两个链霉菌菌株：一个是从土壤中分离的，一个是从鸡的咽喉分离的。这两个菌株和瓦克斯曼在1915年发现的链霉菌是同一种，但是不同的是它们能抑制结核杆菌等几种病菌的生长。据萨兹说，他是在1943年10月19日意识到发现了一
种新的抗生素，也即链霉素。几个星期后，在证实链霉素的毒性不大之后，梅奥诊所的两名医生开始尝试将它用于结核病患者，效果出奇的好。1944年，美国和英国开始大规模的临床试验，证实链霉素对的效果非常好。它随后也被证实对鼠疫、、伤寒等多种传染病也有效。与此同时，瓦克斯曼及其学生继续研究不同菌株的链霉菌，发现不同菌株生产链霉素的能力也不同，只有4个菌株能够用以大规模生产链霉素。
药理作用及副作用
链霉素是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。使DNA发生错读，导致
无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类进入菌体，细菌细胞膜断裂，细胞死亡。[4]
1、链霉素容易损害听觉神经，可以引起眩晕，运动时失去协调（我们称共济失调）；可以引起耳鸣，听力下降，严重时出现耳聋。上面提到不能用于孕妇的主要原因就在于它可以影响胎儿的听觉神经，以后产生听觉障碍。因为，由于医疗单位不够认真负责，或者由于不懂药理知识乱用链霉素，引起所谓“先天性”耳聋，在过去由于人为的原因造成儿童听力障碍残疾的教训也是较多的。
2、产生链霉素过敏反应的人很少，但还是有的。轻的出现发热、药物性皮疹，严重的会发生剥脱性皮炎（是一种全身性的严重的皮肤病），甚至过敏性休克。所以，有链霉素和其他药物过敏史者不用或慎用。
3、前面已介绍过链霉素属氨基糖甙类抗菌素（其他如庆大霉素、小诺霉素、妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等等均属此类抗菌素）对肾脏的毒性较多，肾功能有损害的病人应该少用和不用，即使一定要用，必需经常查验肾功能和尿常规，老年人因药物血浓度维持时间比年轻者长，所以，应用链霉素要减量和谨慎使用，并进行严密观察。
4、有的病人可以出现口唇周围和面部的麻木感。轻者不须停药，重者必需在专门医师的指导下减量或停药。
总之，链霉素的副反应，少数病人反应严重，所以，链霉素的使用必须在医生的指导下应用，千万不要乱用和过量使用。
链霉素的用途
链霉素是从放线菌属的灰链丝菌的培养液中提出的。是一种碱性甙，与酸类结合成盐，兽医临床上常用的是硫酸链霉索。硫酸链霉素为白或类白粉末，无臭、味微苦、有吸湿性。水溶液中易失效，故分装成1克（100万单位）或2克（200万单位）的无菌粉末。链霉素属窄谱抗生素
，主要对革兰氏阴性杆菌如大肠杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、布鲁氏菌、鼠疫杆菌等有抗菌作用。特别对结核杆菌作用较强，在低浓度时有抑菌作用，在高浓度时有杀菌作用。但对大多数革兰氏阳性菌不如青霉素，对梭菌、真菌、立克次氏体、病毒等无效。主要用于牛乳腺炎、牛出败、猪肺疫、禽、牛结核病等的。临用前加灭菌注射用水适量使溶解。肌内注射一次量，家畜每1公斤体重10毫克，每日注射2次。 硫酸双氢链霉素是将链霉素中链霉糖部分的醛基氢化后所获得的另一种链霉素制剂。其抗菌作用、用法用量均同硫酸链霉素，但其毒性较硫酸链霉素大，主要损害耳蜗。一旦听觉丧失则不易恢复。人用药已淘汰，但作为兽药还在使用。
链霉素引起的不良反应
链霉素与双氢链霉素均可和血清蛋白质结合形成全抗原，但所产生的抗体不同，因此无交叉反应，对链霉素过敏者可用双氢链霉素。然而有对二者均过敏史，颇须注意。过敏反应包括：皮疹(0.3％～11％)，可表现为斑丘疹、荨麻疹、红斑、麻疹样皮疹、猩红热样皮疹、天疱疮样皮疹、湿疹样皮疹、紫癜及血管神经性水肿等皮肤表现。严重者可发生过敏性休克，严重过敏者反应还可并发急性溶血性贫血、血红蛋白尿、休克、急性肾功能衰竭。
1)急性毒性反应：麻木、头晕、耳聋等为多见，多在用药后10天内出现，最短者于注射后20分钟内出现麻木，持续1～6小时，重者可延续24小时尚不消失。亦有发生口周麻木、头晕、运动失调、头痛、乏力、呕吐、颜面潮红，严重者亦有发生大汗、呼吸困难、痉挛不易与过敏性休克区分者。但急性反应多见累积或渐次加重现象，部分病例仅在开始注射时出现反应，以后即消失。链霉素的急性反应一般认为与其所含杂质有关。
2)慢性毒性反应： ①第八对颅神经损害；a)耳前庭系损害，主要表现眩晕、头痛、经常指误等。以后出现运动性共济失调等；b)耳蜗系损害：一般发生较迟，常在用药数月后或停药以后发生。其主要症状是耳鸣和耳聋。 ②对局部的刺激：肌注局部疼痛、肿胀、无菌性脓肿等，鞘内注射可引起发热、苍白、激动、胃纳减退、抽搐、休克，严重者可导致死亡等。 ③对肾脏的损害：链霉素对肾脏的损害较轻，表现为蛋白尿和管型尿，部分出现肾功能暂时减退，停药后可恢复，严重的永久性肾损害并不多见。 ④对骨髓的抑制：表现为白细胞、血小板减少，再生障碍性贫血及血细胞全少症等。以白细胞减
少常见，再障及全血细胞减少偶见。⑤还有多毛症、结膜炎、关节痛、心肌炎、中毒性脑病
等。
链霉菌产生的抗生素
链霉菌可以产生多种二次代谢物，包括各种物质的分解酵素及抗生物质。这些代谢产物除了可用在人体的医药以及当成家畜饲料的添加物外，在农作物生产方面，也可做为植物保护之用。链霉菌是已知放线菌中最大的族，可产生高达一千多种的抗生物质，许多重要的抗生素如放线菌素、链霉素、四环霉素、保米霉素、维利霉素、嘉赐霉素及康霉素等，都可由链霉菌生产。一般而言，农用抗生素具有较低毒性及残留性质，可以抑制病原微生物的生长和繁殖，或者能改变病原菌的形态而达到保护作物的效果。
链霉菌产生的抗生素种类繁多且结构复杂，从结构上区分，大致可把农用抗生素分为下列六大类：
氨基糖类抗生素：这类抗生素属于糖的衍生物，由糖或氨基酸与其它分子结合而成。在植物体内具有移行性，可干扰病原细胞蛋白质的合成，如链霉素。
四环霉素类抗生素：这类抗生素是由四个乙酸及丙二酸缩合环化而形成，可以抑制病原菌核糖体蛋白，如四环霉素。
核酸类抗生素：这类抗生素含有核酸类似物的衍生物，作用于病原菌的去氧核糖核酸合成系统，抑制其前驱物或酵素的合成，如保米霉素。
大环内酯类抗生素：它是由 12 个以上的碳原子组成，且形成环状结构，通常可和细菌的 50 核糖体亚基结合，以阻断蛋白质的合成，如红霉素。
多烯类抗生素：由 25 ~ 37 个碳原子组成的大环内酯类抗生素，含有 3 ~ 7 个相邻的双键，可与病原真菌细胞膜上的类固醇结合，有破坏细胞膜的功能，如治霉菌素。
多肽类抗生素：这类抗生素是把氨基酸用不同的肽键结合，经常形成网状结构，可以抑制病原菌细胞壁的合成，如纯霉素。
由于多数链霉菌具有分泌抗生物质或细胞外酵素的能力，可以有效抑制植物病原菌。此外，少部分还具有促进植物生长或诱导植物产生抗病性的效果，因此链霉菌在生物防治应用上极具潜力。[5]
链霉菌菌种鉴别
观察链霉菌的形态可以用一种比较特殊的方法，在灭菌的载波片上滴一滴熔化了的琼脂培养基，使琼脂展成一薄膜，用针尖接种，在无菌条件下一定湿度环境中培养，生长后将载波片干燥，然后染或直接用相差显微镜观察，这样就可以完全按照菌的发育原样观察形态，而不受制片过程对菌的干扰。
也可将灭菌后的玻璃纸覆盖在培养基平皿上，在玻璃纸上接种孢子，在生长的不同阶段将玻璃纸剪下一小部分，进行形态观察。直接将载玻片在生长良好的菌落上压放，然后在显微镜下可以观察链霉菌的气生菌丝或孢子丝。孢子的形态需用电子显微
镜，将特制的酮望在菌落上压放，干燥后在电子显微镜下观察。细菌染的方法通常可用于放线菌的染，常用的有结晶紫，亚甲蓝等。细菌的核染法以成功得应用于正在形成孢子的放线菌染，用锇酸在1mol/L盐酸中固定细胞，吉姆萨染料染，再用丙酮和二甲苯脱水。用DNPI（4',6'-二胺-2-异硝基苯胺）染，在荧光显微镜下可以观察细胞内类核题，现在发展了一种绿荧光染料SYTO9可以染活或死亡的细胞二碘化丙腚由于其不能通透细胞壁只能染死亡的细胞，当两种染料同时使用时，死亡细胞与二碘化丙啶结合后降低了与SYTO9的结合能力，因此被染成红。[6]
链霉素传统工艺
链霉素早期的提取方法采用活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。目前国内外多采用离子交换法提取链霉素。 然而链霉素发酵液中绝大部分是菌丝体和未用完的培养基，以及各种各样的代谢产 物，如：蛋白质、多肽、素和Ca2＋、Mg2＋离子等等，链霉素浓度远较各种杂质的低， 仅为5000单位/毫升左右。大量蛋白、多肽和高价离子(Ca2＋、Mg2＋)的存在对离子交换吸 附影响很大。在离子交换处理前，一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变 性。添加磷酸或一些络合剂如三
聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不 溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。这一预处理将导致10％ 以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品 纯度、污染环境。同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会 减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加 抗生素提炼的成本。[7]
此外采用离子交换法提炼链霉素，总收率不高，只达72％。同时需大量解吸液。解 吸液中链霉素浓度低，各种杂质如素、金属离子等含量较高，造成下游工艺处理困难 ，产品纯度不高。
三达新工艺
膜法工艺取代链霉素生产中的薄膜蒸发工艺，使这一问题得到了很好的解决。膜分离是一种无相变的纯物理手段，能在任何膜能承受的温度下对料液进行分子水平的分离。清洁，环保，占地少，另外它的一大优势是运行成本低，去除一吨水的成本比普通的三效蒸发器低，有效地控制产品，提高了产品的质量。
Flow-Cel超滤技术替代传统的板框压滤/鼓式真空过滤方法。 其最大的特点是在不需要加入助滤剂、絮凝沉淀剂及其他任何化学试剂的情况下，不仅可把菌丝体及其他固体杂质完全分离，而且可以把99％以上的蛋白(包括溶解性的蛋白) 与菌丝体一起剔除。
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