微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以“散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。 一、实验目的：
1． 学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2． 学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
二、实验原理：
在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。 三、实验材料和用具：
1．材料
（1） 土壤样品
（2） 培养基：
① 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（%）
牛肉膏 0.3-0.5g
蛋白胨 1.0g
NaCl 0.5g
琼脂 2.0g
蒸馏水 100mL
pH 7.2-7.4，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。该培养基为多数细菌通用培养基，可用于菌种的分离纯化及保藏斜面。
2．用具
无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。
四、实验方法：
1．稀释涂布平板法：
（1）倒平板
将灭菌的培养基加热融化，倒平板。琼脂是固体培养的支持物，它在95℃融化，40℃以下凝固，将已灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基融化后（水浴融化）冷却至45-50℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉或烫死；温度过低，则培养基凝固，不易倒出）。
倒平板方法：右手的虎口、姆指和食指握住三角瓶，左手翻转手掌，以无名指与小指在火焰处拔出棉塞（或塑料试管帽、硅胶泡沫塞），微烧瓶口一周，左手把皿盖打一缝，容三角瓶口探入（见图1 ）倾入培养基后，迅速将皿盖盖妥，平放桌上，轻轻旋转，使培养基与土壤稀释液充分混匀，待凝固后，即成平板。
图1 将培养基倒入培养皿内
（2）稀释土样：
称10克土样，在火焰旁加到有90 mL无菌水和少许玻璃珠的三角烧瓶内，将瓶子依左右方向振荡数十次（或在振荡器上振荡分散），使土样与水充分混合，将菌分散，土样中的菌被稀释了10倍，土壤悬液的稀释度为10-1。在火焰处打开无菌吸管的纸套（或用微量加样器装上无菌的塑料吸嘴），用无菌吸管吸取土壤悬液1mL，加到一个盛有9mL无菌水的试管内，稀释100倍制成稀释度为10-2的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的
吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出1mL菌液，加到另一支9mL无菌水中，制成稀释度为10-3的土壤悬液（图2）。用微量加样器亦需反复吸吹3次，用毕弃去塑料吸嘴。同法按每级稀释10倍的次序得到10-4、10-5、10-6的土壤稀释液。
图2 稀释过程示意图
（3）涂布及培养
将上述稀释好的土壤菌液，用最后一支吸管（或塑料吸嘴），由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.1 mL加到编号为10-6的培养皿中央，再依次分别从10-5、10-4试管中各吸取0.1 mL稀释液，加到相应编号的培养皿中央，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。 用无菌玻璃棒按照图3所示，在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5-10 min，使菌液吸附进培养基。将培养皿倒置于37℃的恒温培养箱内培养1-3天，每24 h观察一下菌落的生长状态，并记录细菌、霉菌菌落的数目并描述所见菌落的形态。
图3 平板涂布操作图
（4）挑菌落
将培养出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到斜面培养基上。置于37℃的恒温培养箱内培
养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染后用显微镜检查是否是单一微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
斜面接种技术：操作时按图4 的顺序，并注意教师的示范操作。
① 试管先贴上标签，注明菌名、日期和姓名，然后将菌种斜面和欲接种斜面试管架在左手虎口之上，用食指和中指夹住试管，大姆指按在二管中央，菌种管口在外方，斜面稍朝上。
② 先将棉塞（或塑料帽、硅胶泡沫塞）用右手扭转松动，以利接种时拔出。
③ 右手拿接种环末端，使其垂直于火焰中，烧红灭菌。
④ 用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞。
⑤ 以火焰灼烧管口，烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量杂菌得以烧死。
⑥ 将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管。
⑦ 迅速将接种环在火旁伸进欲接种试管，在培养基上轻轻划蛇形线，划线时要由底部到顶部，由下而上，但不要把培养基划破，也不要使菌种污染管壁。
⑧ 火焰灼烧试管口，并在火旁将塞塞上，塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时污染杂菌。
⑨ 放回接种环前，将环在火焰上再烧红灭菌，放下接种环后，再腾出手将棉塞塞紧。
图4斜面接种技术
2 平板划线分离法
为了保证菌落为单克隆，在稀释涂布平板培养分离的基础上进行平板划线再分离操作。
（1）倒平板：按照稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、菌落编号和实验日期。
（2）划线：左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接种环取稀释涂布平板培养的细菌菌落一环在平板上划线，划线分离后，置于37℃温箱中，培养1~2天，即出现单个菌落。
划线方法一： 用接种环以无菌操作取细菌悬液一环，在平板培养基的一边，做第一次平行划线2~3条。转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种环，通过第一次划线部分，做第二次平行划线。用同法通过第二次平行划线，做第三次平行划线。
图5 划线分离方式1、2、3表示划线次序
划线方法二：先以沾有细菌悬液的接种环在平板的一端涂抹一下，使该处沾上一些细菌，然后，烧掉环上剩下的细菌，再用烧过冷却的接种环，通过刚才涂抹的部分，左右划线，不能互相接触（图5）。划线时，注意接种环与平板表面约成20~30°角，划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法。
3．根据菌落及培养特征鉴别微生物的类型
由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性以及产生素的能力等各不相同。因而个体在固体培养基或液体培养基上生长的情况，往往各有特点，按照微生物在固
体培养基上形成菌落的特征，可用来初步辨别是何种类型的微生物，应注意菌落特征的形状、构造、大小、颜、透明度、气味及粘滞性等。一般来说，
（1） 细菌和酵母的菌落是比较湿润的，用接种环极易将菌体挑起。
（2） 放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基紧密结合，不易被针挑起。
（3） 霉菌菌落呈蛛网状、绒状或棉絮状。
如果要鉴定菌种，则对于微生物在液体培养基中以及在斜面培养基上生长的特征都应比较详细地观察，通常用接种针挑取菌体少许，在斜面上由下到上部划成直线接种，培养后，观察生长旺盛的程度，形状，颜及光泽等（图6）。
图6 平板上细菌菌落和斜面划线生长的形状
五、实验内容：
1． 按教师指定的小组进行从土样中用释释分离法分离细菌，待单菌落长出后，移接斜面培养，并计算出每克土中样微生物的数量。
2． 从稀释涂布平板上挑去疑似单菌落用平板划线法进一步分离出细菌的单菌落，纯化，并移接斜面培养。
六、实验报告：
1．选择刚好能把菌分开，而稀释倍数最低的平板（一般含菌落20-300个），计算每克土中样微生物的数量：
2. 从菌落大小、形状、隆起状态、边缘形状、表面光泽、与培养基结合程度等方面描述典型细菌的菌落特征，并注明培养名称、培养温度及培养时间。
七、思考题：
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