抗性指标实验方法
一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） （测量避光，光影响极大）
【仪器、材料与试剂】
（一）仪器
1. 分光光度计
2. 台式离心机
（二）材料
1. 磷酸氢二钠
2. 磷酸二氢钠
3. 甲硫氨酸
4. EDTA-Na2
5. 核黄素
6. 氮蓝四唑(NBT)
7. 陶瓷小研钵
8. 4-5ml 离心管
9. 10ml 玻璃试管
（三）试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。
3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。
【实验步骤】
1. 酶液提取
称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min；
（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560） 3. 计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性 n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2
SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。
【注意事项】
1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；
2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。
4. 加反应液时最好在暗光下进行；
5. 核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；
6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。）
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