一.实验内容
10%三（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)
实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：
考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸
实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂： dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素
实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：
PBS（PH=7.0） 30% H2O2
实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：
ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O
实验6： ASA(维生素C)含量测定
偏磷酸 95%乙醇 磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）
实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：
NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)
实验8：脯氨酸测定所需试剂：
磺基水杨酸 甲苯 茚三酮 冰乙酸 85%磷酸
试验9：叶绿素含量测定。
80%丙酮
试验9：GR活性测定
试验10：过氧化氢含量测定。
三
试验11：超氧阴离子含量测定
二．酶液和母液提取
1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）
2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸
1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：
1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）
↓
4℃冷冻15000g离心20分钟
↓
上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）
2．ASA . GSH母液提取：
0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液
↓
4℃冷冻14000g离心10分钟
↓
上清液即为母液（5℃下保存备用）
（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）
酶液提取所需试剂：
PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS
EDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBS
PBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O
取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用
PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)
需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）
母液提取所需试剂：
5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒
（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）
（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）
三．实验步骤
实验1：MDA含量测定
1.1所需试剂：10%三（TCA）（纯） 称10g定容至100ml
0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml
（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）
1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，
加入 4ml 0.25%的硫代酸（溶于10%的三）溶液
↓摇匀
95℃加热15分钟
↓快速冷却
3000g离心15分钟
↓
取上清测定 OD532，OD600，OD450值
↓
按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)
可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)
最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]
同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1
（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）
注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零
MDA含量测定的改进
1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代酸（溶于20%的三）溶液。
实验2：可溶性蛋白含量
（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）
2.1所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA），考马斯亮蓝G-250 ，95%乙醇，85%磷酸
考马斯亮蓝G-250蛋白染剂的配制：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L，混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕瓶中，常温下可放置一个月。
●标准曲线制作：
① 标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml，制成100μg/ml的标准液，4℃下保存备用。（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒）
② 取6支具塞试管（10ml），按下表配制含0-100μg/ml的牛血清蛋白液各1ml（★调零管）
| ★ 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
蛋白标准液（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
蛋白含量（μg） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| | | | | | |
③ 各试管加入5ml G-250染剂，翻转混合，放置2分钟，595nm比，绘制过原点标准曲线（方程式）。（相关系数要两个9以上）
2.2步骤：
①标准曲线（参考邹琦）（595nm比）
注意：制作通过原点的标准曲线，以含0μg蛋白质液调零
②取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定
③1ml样液+5ml G-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比，直接从标准曲线读含量。
（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）
实验3：SOD酶活性
3.1步骤：
1. 取50μl酶液
①加入2ml 39m mol/L 甲硫氨酸（Met）
②2ml 0.225m mol/L NBT , （氮蓝四唑）
③1ml 0.6m mol/L EDTA-Na2（① ② ③可以配制在一个试剂瓶里）
④1ml 0.012m mol/L 核黄素，摇匀。（现配现用）
2．（人工培养箱内）4000Lχ日光灯下放置30分钟后，温度控制在30℃ ，于暗处终止反应。
（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四次。对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）
3．560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。
（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。）
3.2所需试剂：
dl-甲硫氨酸（Met） 39mmol/L 1.1638g/200ml
NBT 0.225mmol/L (0.01840克)/ 100ml 0.0368g/200ml
EDTA-Na2 0.6mmol/L 0.0223g/100ml
核黄素 0.012mmol/L 0.0045g/L或 0.0045g/100ml 用时稀释10倍
各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。
试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法：
Met + NBT + EDTA-Na2
200mll+200ml+100ml
SOD酶测定时，酶液量50μl偏少，改为100μl为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。
SOD活性（酶单位u/gFW）=(A0-A1)*V / A0*0.5*FW*a
A0---对照照光管光吸收值； A1---样品管光吸收值。
V---样液总体积（ml）5ml FW---鲜重（g） 1g a---测定用样品的量（ml） 0.1ml
实验4：CAT活性（过氧化氢酶）
4.1所需试剂：
①PBS（PH=7.0）50mmol/L （61份50mmol/l Na2HPO4, 39份50mmol/l NaH2PO4）
②15mmol/L H2O2(以30% H2O2配 )
（取85.2μL 30% H2O2，以50mmol/L PBS((PH 7.0)定容至100ml）
4.2步骤：
1. 3ml 50mmol/L PBS (PH7.0)加入50μl酶液
（加比杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）
再加入5μl 15 mmol/L H2O2 摇匀（加比杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。
2．240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）
3．CAT活性以每分钟消耗1μmol的H2O2为一个酶活单位。
活性计算改动：（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u）（2005和2006年均是按OD值减少0.01算的）（以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u）
注意：以PBS作空白调零50mmol/L
实验5：APX活性(抗坏血酸过氧化物酶)（即ASA—POD活性）
5.1所需试剂：
ASA（分子量167.12） 0.3m mol=0.052836 (g)
(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 (以PBS配成0.1m mol/L=0.0372 (g)/L)
50m mol/L PBS (pH7.0)
9m mol/L H2O2 (以30%H2O2配制)
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