医学形态学论文

小鼠腹水型肝癌细胞系HCa—P／L6淋巴道高转移实验

[murine ascites hepatocarcinoma cell line with high lymphatic metastatic potential(HCa—P／L6)]

七年制08级6班 Q080100191 王晓露

【摘要】[目的]掌握可移植性小鼠腹水癌淋巴道转移实验的操作过程；了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。[方法](1)细胞系获取(2)615小鼠腋窝皮下接种肿瘤细胞(3)组织取材(4)切片染:石蜡切片法,H.E.染法。[结果]15只实验小鼠中0只死亡，光学显微镜下观察，在皮下瘤体和同侧腋下淋巴结中发现同样类型的肿瘤细胞（即ＨｃａＦ），远处脏器未见到转移的肿瘤细胞。

[结论]可移植性小鼠腹水癌经淋巴道向其他部位发生转移。

【Astract】[0bjective]Master portability mice ascties cancer lymphatic metastasize experimental operation process；Understanding tumour animal experimental model of the process and significance.[Methods](1)cell line achieve(2) The armpit subcutaneous tumor c

ells in mice inoculated(3) Organization based(4) Slice dyeing: Paraffin method,H.E. stain method. [ Results] There are 15 laboratory mice .No dead in the laboratory Optical microscope, In the subcutaneous pseudoaneurysm with side axillary lymph node and found in the same type of cancer cells (HcaF), The distance viscera not seen transfer of tumor cells .[ Conclusions] Portability mice ascties cancer via the lymphatic way to other parts of the shift

【关键词】615小鼠，肝癌，Hca-P;淋巴道转移

【文献标识码】A

【前言】H22肿瘤瘤株属小鼠的肝细胞瘤,系1952年苏联医学科学院肿瘤研究院(莫斯科)用O-Ptoaminoa-zotolyol(OAAT)涂C3H小鼠的皮肤100次后诱发,皮下传代的肝脏实体瘤。1963年中科院上海药物所引进后将肝脏实体型瘤株变成腹水型瘤株(其腹水型又称Hca,HAC或HepA),被广泛应用于肿瘤淋巴道转移机制研究及药物筛选。实验目的通过可移植性小鼠腹水癌淋巴道转移实验,从感性上认识肿瘤侵袭与转移的生物学特性,了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。

1.实验材料

(1)研究对象:1)细胞系小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa-P，由大连医科大学病理学教研室建株并保存

2)实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6~8周龄，体重18~22g，由大连医科大学实验动物中心提供

(2)主要试剂及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%福尔马林固定液等。

2.研究方法

(1)细胞系获取

从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F）塑料冷存管，立即放入40℃的温水中，1分钟内使冻存液全部融化，立即放入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤两次，离心，弃上清，再加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHc

a-f细胞悬液，于第六天无菌条件取腹水。计数细胞，用生理盐水配成密度为2×107个细胞/ml的细胞悬液。

(2)615小鼠皮下接种肿瘤细胞

取615小鼠癌性腹水0.1ml，内含2×106个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下。局部严格消毒。注射针头进入皮下。定期检查右腋皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧有关淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于10%福尔马林固定液中，石蜡包埋制片，HE染，显微镜检查。

(3)组织取材

将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚约2~3mm的＜2×1cm大小的组织块，10%中性福尔马林固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24~48小时。经冲洗、透明、浸蜡，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染制成切片，一般常规作HE染。

(4)切片染:石蜡切片法,H.E.染法

1)脱水程序及时间:组织固定→冲洗→脱水→ 透明→浸蜡→修蜡块→切片→烘烤切片→ 染

2)HE切片染程序与方法:

①切片脱蜡水洗(与脱水过程相反)

hca2

②HE染

③脱水,透明,封固

【结果】:显微镜观察淋巴结转移的分布与转移率

1．皮下瘤体：

大体：皮下瘤体较大，呈灰白，质硬，与皮下组织黏附紧密、界限不清。

ＬＭ：瘤细胞分布不规律（组织结构异型性），细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，呈嗜碱性（细胞异型性）。

2．同侧腋下淋巴结：

大体：比正常淋巴结大，呈卵圆形，质硬，切面灰白。

ＬＭ：在淋巴结的边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，与在皮下瘤体的切片中看到的瘤细胞形态相似，表明此淋巴结中的肿瘤组织是原发在皮下的肿瘤经淋巴道转移的结果。

3．肺、肝、肾；

大体：未见异常

ＬＭ：未见到组织结构和细胞的异型性。表明此种肿瘤未经血道转移

【讨论】:

1.为什么选用615小鼠做小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株的移植瘤实验？

615近交系小鼠是中国医学科学院血液学研究所1961年5月用本所饲养的昆明种白化雌性小鼠和由前苏联引进的C57BL血研黑雄性近交系小鼠杂交而得的第一代后，用杂交第一代严格按照同胞兄妹交配的原则连续繁殖20代以上得到的一系棕小鼠。由于615小鼠淋巴系统比较发达且有许多近交系，部分近交系有其特定的自发性肿瘤，可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处做为动物模型进行肿瘤发生、发展和的研究。同时，胸腺严重缺陷的裸小鼠可接受人类各种肿瘤细胞的植入，成为活的癌瘤细胞"试管"，是研究人类肿瘤生长发育、转移和的绝佳动物。

2.为什么选用615小鼠的右腋皮下作为肿瘤细胞的接种部位?

因为小鼠右腋皮下腋下作为肿瘤细胞的接种部位是其由于此处的淋巴结相对较多，且有血循环丰富，利于肿瘤的转移的优点。

3.恶性肿瘤细胞转移的可能机制有哪些?

①淋巴道转移（lymphatic metastasis）:恶性肿瘤侵入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转以后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移（Troisier sign）或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移（skip metastasis）。

②血道转移（hematogeneous metastasis）:恶性肿瘤细胞侵入血管后可随血流到达远处器官继续生长，形成转移瘤。血道转移的途径与血栓栓塞的过程相似，即侵入体循环静脉的恶性肿瘤细胞经右心到肺，在肺内形成转移瘤。此外，侵入胸、腰、骨盆静脉的恶性肿瘤细胞也可以通过吻合枝进入脊椎静脉丛。

③种植性转移（transcoelomic metastasis）：体腔内器官的恶性肿瘤蔓延至器官表面是，其肿瘤细胞可以脱落，并向播种一样种植在体腔内各个器官的表面，形成多数的转移瘤，这种方式亦称为播种。值得注意的是，手术也可能造成医源性种植性转移。

4.根据是否能贴附在支持物上生长的特点分类：

体外培养细胞可分为贴壁型和悬浮型两大类。贴壁型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，大多数培养细胞呈贴附型生长。要想使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞，必须使用胰蛋白酶等消化液消化，如果消化过头或不当，消化液则可以使细胞膜结构损伤，影响实验结果。悬浮型细胞在培养时不贴附于支持物上，而是呈悬浮状态生长在培养液中，其优点是细胞生存空间大，容许时间长，能繁殖多量细胞，在与药物作用时，可以与药物充分接触，药物敏感性高，而且不需用消化液处理，细胞膜结构不遭到破坏。HCa—P／可在小鼠腹腔传代，呈自由悬浮式生长，短期内可获得大量活性特别好的细胞，可应用于大规模药物筛选之中。

5.目前，因缺乏特异的肿瘤淋巴道转移模型，明确的淋巴道转移相关基因还未见报道。哪些基因控制调控了肿瘤的淋巴道转移，淋巴道转移的机制与血道转移有何区别等都知之甚少。作为恶性上皮肿瘤早期转移的主要形式，淋巴道转移机制的解析对临床肿瘤转移的诊治有着更为积极的意义。

【参考文献】

1. 李海燕,方肇勤,梁尚华。小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用，中国中医基础医学杂志，2000，6（1）：27

2. 凌茂英,刘希风,郑怀祖,等.小鼠肝癌细胞系H22-F25/L的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志,1991,13(1):13.

3. 孙成荣, 唐建武, 孙明忠,等. 采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白[ J ]. 生物化学与生物物理进展, 2007, 34 (8) : 856 - 864.

4. 陈桑, 凌茂英, 刘希风,等. 小鼠腹水型肝癌高、低转移克隆稳定性的研究[ J ]. 大连医学院学报, 1992, 14: 32- 37.