防治炎症性肠病的胆汁酸代谢菌及其应用

1.本发明是关于一种防治炎症性肠病例如溃疡性结肠炎的菌及其应用，具体而言，本发明是关于一种防治炎症性肠病的胆汁酸代谢菌、包含所述菌的组合物及相关应用。

背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease,ibd)是慢性的反复发作的肠道炎症性疾病，患者常常在小肠和大肠黏膜处有持续性的溃疡，主要分为两种类型，溃疡性结肠炎和克罗恩病(crohn’s disease,cd)。ibd的可能病因包括：遗传易感性、肠道菌等环境因素、吸烟和饮食等社会行为，此外，ibd风险增加与儿童早期接触抗生素有关。ibd的相对流行率因地理区域的不同而有很大差异，其病理特征类似但也有明显区别。ibd复发高，病程长，难治愈，预后差，目前尚无可根治的药物或方法。
3.ibd的病理生理机制尚不十分清楚，通常发生于免疫系统对正常存在于肠道的菌产生过激的免疫响应后，激起一连串的破坏和摧毁肠壁的炎症事件。肠道粘膜屏障将共生菌与肠道上皮分隔，粘膜处的免疫细胞抑制共生菌的积累及易位，一些ibd相关基因突变可导致粘膜屏障或免疫应答受损，引起肠道菌及免疫平衡的失调。迄今，已有大量文献报道了ibd与菌失调的关联，菌变化对肠道炎症的影响机制包括：调节treg细胞其它免疫细胞、调节促炎及抑炎因子、直接侵入肠道上皮细胞等。肠道作为最大的免疫器官，目前关于ibd的研究多聚焦短链脂肪酸，而胆汁酸则多认为与糖尿病和脂肪肝等代谢性疾病相关，鲜少有研究去探讨ibd与胆汁酸的关系，因此，研究ibd过程中的炎症与胆汁酸及菌的关联，将对ibd的预防和提供新的策略。
4.目前已有的相似方案包括：honda等通过特定培养基筛选到17种能调节免疫反应的细菌用于ibd；daniel van等通过生信分析商用菌株库，设计了gut-103和gut-108两个合成菌用于ibd。
5.以往研究中所涉及到的合成菌的菌株是通过在培养基中加氯仿获得的能耐氯仿的菌株，缺乏理性设计。而基于生信分析所筛选的菌株，对所关注的肠道菌代谢物也缺乏体外代谢检测验证。

技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供可以防治炎症性肠病的菌。
7.本发明的另一目的在于提供所筛选得到的菌的应用。
8.本案发明人在研究中，基于人类微生物数组数据，针对ibd患者粪便缺乏次级胆汁酸的现象，通过基于生信分析和体外代谢检测相结合筛选到了能把结合型初级胆汁酸代谢成次级胆汁酸的菌特别是合成菌，并进一步把所设计的菌灌胃用于dss-诱导小鼠模型，验证了该菌对小鼠肠炎指标的改善情况，证明了本发明的菌为胆汁酸代谢菌，本发明的菌为能改善ibd症状的合成菌。
9.具体而言，本发明提供了三株能把结合型初级胆汁酸代谢成次级胆汁酸的菌株，
本发明中分别命名为clostridium sp.da266、eubacterium limosum da510、bacteroides ovatus da668。这三株菌株均已进行了保藏，其中：
10.菌株clostridium sp.da266，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62707；分类命名：clostridium sp.。本发明的菌株clostridium sp.da266亦称为clostridium sp.:gdmcc-62707。
11.菌株eubacterium limosum da510，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62708；分类命名：eubacterium limosum。本发明的菌株eubacterium limosum da510亦称为eubacterium limosum:gdmcc-62708。
12.菌株bacteroides ovatus da668，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62709；分类命名：bacteroides ovatus。本发明的菌株bacteroides ovatus da668亦称为bacteroides ovatus:gdmcc-62709。
13.本发明的研究表明，本发明的菌株clostridium sp.da266、eubacterium limosum da510、bacteroides ovatus da668中的任意一种或多种的组合，均具有将结合型初级胆汁酸代谢转化成次级胆汁酸的能力，能改善ibd症状。本发明的这三种菌均可称为胆汁酸代谢菌。
14.从而，一方面，本发明提供了一种菌，其包括以下菌株中的任意一种、两种或三种：
15.保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.；
16.保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum；
17.保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus。
18.换而言之，本发明的菌，可以是单种菌的纯培养物，也可以是包括两种或三种以上菌的菌。
19.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌包括保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.以及保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum。
20.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌包括保藏编号为保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum以及保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus。
21.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌包括保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.以及保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus。
22.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌包括保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.以及保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum以及保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus。
23.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌中，所述保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp具有完整bai基因簇。
24.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌中，所述保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum:gdmcc-62708菌株具有7-α/βhsdh酶。
25.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌中，所述bacteroides ovatus:gdmcc-62709菌株具有bsh酶。
26.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌中包括两种或三种菌株时，各菌株之间的数量比可以为0.01-100：0.01-100，优选为0.1-10：0.1-10，更优选为0.1-10：1。
27.根据本发明的具体实施方案，本发明的菌，其可以为固态或液态菌制剂。可以采用所属领域中任何可行的方式将所述菌制备成菌制剂。优选地，所述菌制剂中的菌为活菌。
28.另一方面，本发明还提供了一种组合物，其包括本发明所述的菌(即保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp、保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum、保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus中的一种、两种或三种)。本发明的组合物因包括所述菌而具有将结合型初级胆汁酸代谢转化成次级胆汁酸的能力，能改善ibd症状。本发明的组合物可以称为胆汁酸代谢组合物。优选地，所述组合物还可包括与本发明的菌具有相同或有利于本发明的菌的功能(例如胆汁酸代谢)的其他活性物质，和/或辅料。根据本发明的一些具体实施方案，所述组合物可以为药物组合物或是食品组合物，所述的食品组合物例如可以是保健食品、特殊医学用途的食品或是膳食。所述的药物组合物或是食品组合物中还可包括药物或食品领域中常规的辅料等。
29.另一方面，本发明还提供了本发明所述的菌或所述的组合物在制备用于预防和/或炎症性肠病的组合物中的应用。
30.根据本发明的具体实施方案，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎。
31.另一方面，本发明还提供了本发明所述的菌或所述的组合物在制备用于缓解炎症性肠病个体体重减轻和/或结肠缩短的组合物中的应用。
32.另一方面，本发明还提供了本发明所述的菌或所述的组合物在制备用于改善炎症性肠病个体的胆汁酸代谢的组合物中的应用。
33.另一方面，本发明还提供了本发明所述的菌或所述的组合物在制备用于改善炎症性肠病个体的肠道菌的组合物中的应用。
34.根据本发明的具体实施方案，本发明的所述用于预防和/或炎症性肠病的组合物可以为活菌制剂或灭活菌制剂。优选地，所述用于预防和/或炎症性肠病的组合物为口服制剂。所述的组合物可以为药物组合物或是食品组合物，所述的食品组合物例如可以是保健食品、特殊医学用途的食品或是膳食。所述的药物组合物或是食品组合物中还可包括药物或食品领域中常规的辅料等。
35.根据本发明的具体实施方案，当所述组合物中包括两种或三种本发明的菌时，各菌之间的数量比可以为0.01-100：0.01-100，优选为0.1-10：0.1-10，更优选为0.1-10：1，例如各菌数量基本相同。
36.根据本发明的具体实施方案，本发明所述的菌按照每天1
×
105cfu～1
×
10
13
cfu的量用于制备所述组合物。优选地，本发明所述的菌按照每天1
×
107cfu～1
×
10
10
cfu的量用于制备所述组合物。
37.本发明的具体实验表明，本发明的三种菌中的一种或多种均能将初级胆汁酸转化成次级胆汁酸，可改善dss-诱导的溃疡性结肠炎小鼠的炎症症状。可以合理预期，本发明的这三种菌的组合的次级代谢产物短链脂肪酸、其衍生物和/或培养液也具有一定的预防和/或缓解炎症性肠病的应用；本发明的这三种菌组合的丰度和/或其代谢物可作为标志物诊
断炎症性肠病。进一步，本发明的技术可以肠道菌作为疾病和给药的靶点，以胆汁酸为物质基础去探讨代谢产生次级胆汁酸的菌株改善ibd的分子机制，基于多组学分析给与能代谢产生次级胆汁酸菌株前后动物模型菌结构变化、差异基因表达、代谢通路调控，系统阐述胆汁酸及能代谢胆汁酸菌株溃疡性结肠炎的分子机制。
附图说明
38.图1显示胆汁酸和短链脂肪酸对肠炎小鼠模型的保护。
39.图2a至图2e显示基于生信分析筛选菌的测试结果和显示三菌体外代谢检测验证。
40.图3a至图3g显示三菌对肠炎小鼠体重变化和结肠长度影响的测试结果。
41.图4a和图4b显示三菌对肠炎小鼠作用后的粪便胆汁酸含量测定结果。
42.图5a和图5b显示三菌对肠炎小鼠作用后的粪便短链脂肪酸含量测定结果。
43.图6显示三菌组合对肠炎小鼠肠道菌的影响的宏基因组测序结果。
44.用于专利程序的微生物保藏：
45.(一)菌株clostridium sp.da266
46.保藏日期：2022年08月18日；
47.保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；
48.保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；
49.保藏编号：gdmcc no:62707；
50.分类命名：clostridium sp.。
51.(二)菌株eubacterium limosum da510
52.保藏日期：2022年08月18日；
53.保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；
54.保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；
55.保藏编号：gdmcc no:62708；
56.分类命名：eubacterium limosum。
57.(三)菌株bacteroides ovatus da668
58.保藏日期：2022年08月18日；
59.保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；
60.保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；
61.保藏编号：gdmcc no:62709；
62.分类命名：bacteroides ovatus。
具体实施方式
63.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而
不用于限制本发明的范围。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
64.实施例1、化合物对小鼠肠炎模型的保护
65.本实施例主要基于化合物对小鼠肠炎模型的保护。经过适应性喂养后，把小鼠分成2个组，分别是bile acid and scfa组，以及dss组,提前预防给药10天后开始造模，即把饮用水换成2％dss水，每天记录小鼠体重造模的第七天牺牲小鼠。结果见图1，与control组比，造模第七天bile acid and scfa组小鼠体重下降显著降低。说明bile acid与scfa联合用药对小鼠的肠炎保护性较好。
66.实施例2、菌株筛选
67.本实施例主要基于生信分析和体外代谢检测相结合筛选能把结合型初级胆汁酸代谢成次级胆汁酸的合成菌。
68.本发明所筛选的菌株库是本实验室前期在健康人肠道粪便样本中通过分离培养得到的48株菌，所有的菌株都经过单克隆纯化，16s rna测序鉴定确定其物种(图2a)；
69.生信分析：筛选具有7-α脱羟基酶、bsh酶、7-α/βhsdh酶菌株的筛选，筛选的数据库来源于本实验室前期从健康人体肠道粪便样本中分离纯化得到的菌株，并进行了全基因组测序，分析结果如下，具有完整bai基因簇的有两株菌，给予体外代谢能力的检测，其中一株本发明命名为clostridium sp.da266；有7α/β的菌株只有一株，本发明命名为eubacterium limosum da510；而bsh则存在于很多菌株中，基于文献报道卵形拟杆菌有较好的肠炎的作用，最终本发明选择了一株命名为bacteroides ovatus da668。这三株菌株均已进行了保藏，其中：菌株clostridium sp.da266，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62707；分类命名：clostridium sp.。本发明的菌株clostridium sp.da266亦称为clostridium sp:gdmcc-62707。菌株eubacterium limosum da510，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62708；分类命名：eubacterium limosum。本发明的菌株eubacterium limosum da510亦称为eubacterium limosum:gdmcc-62708。菌株bacteroides ovatus da668，保藏日期：2022年08月18日；保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；保藏单位地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编：510070；保藏编号：gdmcc no:62709；分类命名：bacteroides ovatus。本发明的菌株bacteroides ovatus da668亦称为bacteroides ovatus:gdmcc-62709。本发明选择了clostridium sp:gdmcc-62707，eubacterium limosum:gdmcc-62708，bacteroides ovatus:gdmcc-62709这三株菌组成合成菌去进行后续体外代谢实验。
70.体外代谢检测验证所筛选设计的菌株是否具有所提及的酶：
①
用脑心浸出液bhi培养基将所筛选的菌株复苏，然后把复苏好的菌液转接到新的含有50μmol初级结合型胆汁酸tcdca/gcdca培养基中，培养48小时，收集培养液；
②
取200μl所收集的培养液，加入等体积乙酸乙酯，剧烈斡旋15分钟，10000rpm离心5分钟，吸取上清乙酸乙酯层至新的1.5毫升的离心管中，晾干，再用200μl 50％甲醇溶解，10000rpm离心10分钟，过0.22um的滤膜，滤液收
集于液相样品瓶中，存放-80℃冰箱。
③
液相谱质谱分析结果如图2b、图2c、图2d、图2e所示，底物tcdca/gcdca被3菌共培养代谢转化产生次级胆汁酸udca和lca。
71.实施例3、组合菌sbe对dss诱导小鼠肠炎模型的保护
72.经过适应性喂养后，把48只9周龄的c57小鼠随机分成6组，每组8只，分别是单菌组(闪烁梭菌组，真杆菌组，卵形拟杆菌组)，组合菌组(两菌组合，三菌组合)，以及对照组。所有给菌组总的菌量相同，即单菌组每天灌胃1
×
109cfu，两菌组合组clostridium sp:gdmcc-62707，eubacterium limosum:gdmcc-62708分别灌5
×
108cfu，三菌组合组clostridium sp:gdmcc-62707，eubacterium limosum:gdmcc-62708，bacteroides ovatus:gdmcc-62709每天分别灌3.3
×
108cfu，对照组灌胃相同体积的空白培养基，连续灌胃10天，在第10天收集各组小鼠的粪便，立即放入液氮罐带会实验室-80℃冰箱保存。然后把小鼠的饮用水换成含2％dss的水，dss-诱导造小鼠肠炎模型，让小鼠自由饮水，继续灌胃，并每天记录小鼠的体重，连续造模7天，收集各组小鼠粪便，牺牲小鼠，收集血清，结肠，记录小鼠结肠长度，粪便，结肠和血液存放-80℃冰箱保存。小鼠体重变化和结肠长度如图3a至图3g，三菌组合缓解小鼠体重减轻和结肠缩短的效果比单菌组和二菌组合好。
73.实施例4、三菌组合对肠炎小鼠粪便胆汁酸和短链脂肪酸的影响
74.从小鼠(喂养方案同实施例3)粪便中胆汁酸含量测定结果(图4a和图4b)可以看出，相较于对照组，灌胃三菌组合3strains组次级胆汁酸dca，udca和lca含量都升高了，该结果于本发明在体外检测中发现3strains能把结合型初级胆汁酸代谢转化成次级胆汁酸的结论是一致的。此外，3菌组合灌胃组短链脂肪酸丙酸和丁酸的量也升高了(图5a和图5b)。
75.实施例5、三菌组合对肠炎小鼠肠道菌的影响
76.从小鼠(喂养方案同实施例3)粪便宏基因组测序的结果(图6)可以看出，给予三菌灌胃相比于dss-control组，肠道菌中一些菌的丰度发生了变化。
77.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种菌，其包括以下菌株中的任意一种、两种或三种：保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.；保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum；保藏编号为gdmcc no：62709的bacteroides ovatus。2.根据权利要求1所述的菌，其中，所述保藏编号为gdmcc no：62707的clostridium sp.具有完整bai基因簇；所述保藏编号为gdmcc no：62708的eubacterium limosum:gdmcc-62708菌株具有7-α/βhsdh酶；和/或所述bacteroides ovatus:gdmcc-62709菌株具有bsh酶。3.根据权利要求1或2所述的菌，其为固态或液态菌制剂。4.一种组合物，其包括权利要求1-3任一项所述的菌；优选地，所述组合物为药物组合物或食品组合物。5.权利要求1-3任一项所述的菌或权利要求4所述的组合物在制备用于预防和/或炎症性肠病的组合物中的应用；优选地，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎。6.权利要求1-3任一项所述的菌或权利要求4所述的组合物在制备用于缓解炎症性肠病个体体重减轻和/或结肠缩短的组合物中的应用。7.权利要求1-3任一项所述的菌或权利要求4所述的组合物在制备用于改善炎症性肠病个体的胆汁酸代谢的组合物中的应用。8.权利要求1-3任一项所述的菌或权利要求4所述的组合物在制备用于改善炎症性肠病个体的肠道菌的组合物中的应用。9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其中，所述用于预防和/或炎症性肠病的组合物为活菌制剂或灭活菌制剂；优选地，所述用于预防和/或炎症性肠病的组合物为口服制剂。10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其中，权利要求1-3任一项所述的菌按照每天1
×
105cfu～1
×
10
13
cfu优选1
×
107cfu～1
×
10
10
cfu的量用于制备所述组合物。

技术总结

本发明提供了一种防治炎症性肠病的胆汁酸代谢菌及其应用。本发明提供了一种菌，其包括以下菌株中的任意一种、两种或三种：保藏编号为GDMCC No：62707的Clostridium sp.；保藏编号为GDMCC No：62708的Eubacterium limosum；保藏编号为GDMCC No：62709的Bacteroides ovatus。本发明的菌能将初级胆汁酸转化成次级胆汁酸，改善DSS-诱导的溃疡性结肠炎小鼠的炎症症状。肠炎小鼠的炎症症状。