Ipr1基因介导巨噬细胞抗结核分枝杆菌的作用机制研究 结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，该病为人兽共患病，不仅对人类健康造成严重威胁，也给养牛业带来严重的经济损失。全球约三分之一的人感染结核分枝杆菌，但仅有约十分之一的感染者发展成活化，说明遗传因素对机体抗结核具有重要影响。
位于小鼠1号染体上的Ipr1基因被证明能抑制结核分枝杆菌和李斯特菌等胞内寄生菌增殖，并将感染的巨噬细胞从坏死转变为凋亡。Ipr1的人类同源基因SP110遗传多态性与结核易感性相关，荷斯坦牛SP110基因多态性也与结核易感性相关。 这些结果表明Ipr1是宿主细胞抗结核的重要基因，阐明其抗结核的分子机制对于结核病的防治和抗病动物育种具有重要意义。但是，迄今为止，Ipr1介导巨噬细胞抗结核的机理尚不清楚。
本文从Ipr1相互作用蛋白及其调控的基因入手研究Ipr1介导巨噬细胞抗结核的机理，主要研究内容和结果如下：1.以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型研究了Ipr1蛋白相互作用组。以RAW264.7细胞为基础，构建了稳定表达生物素化Ipr1的小鼠巨噬细胞RAW-BAP-Ipr1-P2A-BirA和对照细胞RAW-BAP-Ipr1、RAW-BAP-P2A-BirA。 在证明Ipr1被生物素修饰后，比较了未修饰的Ipr1和生物素化的Ipr1的功能，结果证明未修饰和生物素修饰的Ipr1亚细胞定位、蛋白相互作用和介导结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡等方面具有相似的功能。随后采用链亲合素介导的亲和纯化技术分离获得Ipr1蛋白复合物，质谱鉴定复合物蛋白种类，共鉴定出253种Ipr1相互作用蛋白，其中251种为本研究新发现的Ipr1相互作用蛋白。
免疫沉淀验证了Ipr1与蛋白Vcp、Hspa5、Pcna、Rps3a、Ybx1、Vav1、Anxa2、Ncl、Prdx1、Wwox、Eif4g2、Atp2a2、Elavl1、Oasl1、Bag2和Mcm3的相互作用。GO功能注释发现Ipr1的相互作用蛋白参与翻译、RNA加工、蛋白定位、核糖体生物发生、蛋白运输等生物过程。
KEGG通路分析结果表明Ipr1的相互作用蛋白涉及核糖体、剪接体、DNA复制、细胞吞噬作用、内吞作用和错配修复等通路。这些结果说明Ipr1可能还有除介导凋亡外的其他功能。
本研究进一步探究了Ipr1对细胞蛋白翻译可能的作用，结果发现Ipr1抑制细胞整体水平蛋白合成，但这种抑制效应不依赖于Eif2α磷酸化水平的升高。Ipr1与内质网胁迫标志基因Hspa
5的相互作用表明Ipr1可能影响细胞内质网胁迫反应。
2.转录组测序分析了Ipr1对小鼠巨噬细胞蛋白编码基因的转录调控作用。构建稳定表达全长和截短Ipr1蛋白的小鼠巨噬细胞RAW-Ipr1、RAW-Ipr1-M1、RAW-Ipr1-M2和RAW-Ipr1-M3。
转录组测序分析了RAW-Ipr1和对照RAW-Control细胞在结核分枝杆菌感染前后基因表达差异。结果发现在未感染情况下过表达Ipr1上调297个基因，下调483个基因转录(差异倍数大于1.5，P值小于0.05)。
结核分枝杆菌H37Ra感染RAW-Control细胞导致1735个基因表达变化，其中716个基因表达上调，1019个基因表达下调。H37Ra感染RAW-Ipr1细胞对基因表达影响最大，导致808个基因表达上调和1031个基因表达下调。
GO功能注释结果表明Ipr1调控的基因主要参与免疫反应、防御反应、调节细胞增殖、损伤应答、调控凋亡和死亡等生物过程。结核分枝杆菌调控的基因主要参与细胞周期、磷酸代谢、胞内信号通路、细胞分裂、细胞死亡调控、DNA代谢过程、细胞凋亡调控、细胞胁迫应答和免疫反应等生物过程。
比较差异表达基因（Differentailly Expressed Gene, DEG）DEG1和DEG2的发现这两组中152个基因表达趋势相反,包括细胞因子、细胞因子受体和趋化因子。功能注释结果表明DEG1和DEG2中表达趋势相反的差异基因主要参与免疫反应、损伤应答、炎症反应和防御反应等生物过程。
这些结果暗示Ipr1可能通过拮抗结核分枝杆菌诱导的基因，尤其是细胞因子和趋化因子，改变宿主细胞应对结核分枝杆菌感染原有的免疫反应，防止结核分枝杆菌逃避宿主细胞免疫反应。比较DEG2和DEG3中的差异基因发现755个DEG3特有的差异基因。
功能注释结果表明DEG3特有的差异基因主要参与免疫反应、细胞死亡、细胞凋亡、细胞胁迫应答、DNA损伤刺激应答、细胞激活和转录调控等生物过程，体现了Ipr1抗结核的功能，并暗示结核分枝杆菌感染的情况下Ipr1可能通过调节宿主细胞免疫和细胞胁迫反应增强细胞抗结核能力，同时启动细胞凋亡信号以减少细菌扩散。3. Small RNA测序分析了Ipr1对小鼠巨噬细胞miRNA的调控作用。
结果发现Ipr1上调21个miRNA并下调36个miRNA表达。H37Ra诱导小鼠巨噬细胞47个miRNA表达，同时抑制14个miRNA表达。
Ipr1抑制miR-99b-let-7e-125a簇和miR-21a表达，无论是未感染还是H37Ra感染的RAW-Ipr1细胞miR-99b、let-7e、miR-125a和miR-21a表达水平都显著低于对照RAW-Control细胞。测序和qPCR结果还表明Ipr1激活H37Ra诱导的miR-146a和miR-155表达。
此外，本研究还发现结核分枝杆菌诱导的miR-27b和miR-29a在H37Ra感染的RAW-Ipr1细胞中表达水平显著降低。这些结果表明Ipr1通过调控巨噬细胞中与免疫反应相关的miRNA表达，进而改变miRNA靶基因的表达量，最终增强细胞凋亡和清除胞内结核分枝杆菌的能力。
4.构建了Ipr1介导巨噬细胞抗结核的分子模型。本研究结合测序数据和生物信息分析预测miR-125a、miR-99a、miR-99b、miR-342和let-7e的靶基因并进行了验证。
结果发现miR-125a通过作用于Bmf基因3’UTR抑制Bmf表达，并证明过表达Bmf诱导小鼠巨噬细胞凋亡，过表达Bmf三个不同的异构体均增加RAW264.7细胞凋亡率。本研究还对非折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）标志基因表达进行了检测，结果发现过表达Ipr1的RAW264.7细胞中分子伴侣Hspa5和Hspa8显著升高，表明UPR被Ipr1激活。
然而，CHOP和Eif2α磷酸化水平在过表达Ipr1的RAW264.7细胞中显著降低，这与细胞适应内质网胁迫结果相似。造成这种现象的原因可能是由于筛选稳定表达Ipr1细胞的过程中UPR被高度激活的细胞可能发生凋亡，存活的是受到长期温和的内质网胁迫而适应胁迫的细胞。
本文还证明了巨噬细胞瞬时表达Ipr1诱导内质网胁迫反应，Ipr1可能通过与Hspa5相互作用改变其亚细胞定位以引起内质网胁迫。此外，本研究结果还表明Ipr1诱导内质网胁迫是其诱导结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡的关键途径。
mirna靶基因分析基于本文的研究结果，我们推测Ipr1通过多种方式介导巨噬细胞抗结核。一方面，Ipr1通过与内质网分子伴侣Hspa5相互作用激活UPR及其介导的细胞凋亡途径，导致细胞凋亡。
另一方面，Ipr1调控与免疫和细胞凋亡相关的mRNA和miRNA表达，例如Bmf、Pdcd1、Pdcd4、Tnf、Il10、miR-146a、miR-155、miR-125a、miR-21a和miR-99b，起始或促进细胞凋亡和胞内结核分枝杆菌清除。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议